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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是医院感染的重要病原菌之一,也是生物膜感染常见的病原菌。形成生物膜的金黄色葡萄球菌具有高度的耐药性并能逃避免疫系统的攻击,其感染易慢性化并难于控制。因此对金黄色葡萄球菌等临床重要病原菌的生物膜形成机制的研究已成为抗感染领域研究热点。近年来对生物膜的研究已广泛开展,但目前对金黄色葡萄球菌生物膜的形成机制仍不清楚。多项关于金葡菌生物膜形成机制的研究涉及到alpha-毒素,但对其在生物膜形成过程中的表达变化仍未见报道。本研究选用第三军医大学西南医院2004年7月-2004年12月分离的20株野生金黄色葡萄球菌为研究对象,通过生物膜形成实验和alpha-毒素编码基因hla的PCR检测,最终选取可形成明显生物膜并携带hla基因的菌株X428进行研究。采用免疫荧光技术和激光扫描共聚焦显微镜技术对其生物膜形成过程进行观察,并对生物膜形成过程不同阶段的alpha-毒素的表达进行检测分析,以期探讨alpha-毒素在金葡菌生物膜形成过程中的表达变化,为进一步研究生物膜的形成机制奠定基础。研究分为三部分进行:1.金黄色葡萄球菌生物膜形成检测及alpha-毒素编码基因hla的PCR分析;2.激光扫描共聚焦显微镜观察金黄色葡萄球菌生物膜形成过程;3.金黄色葡萄球菌生物膜形成过程中alpha-毒素的表达分析。1.方法1.1金黄色葡萄球菌生物膜形成检测及alpha-毒素编码基因hla的PCR分析金黄色葡萄球菌生物膜形成检测采用96孔板番红染色法; PCR法检测alpha-毒素编码基因hla,参照Genebank网站上(注册号X55185)的基因序列,采用Primer Premier5.0软件针对hla设计引物,并对可形成明显生物膜菌株的PCR产物进行测序,在Genebank网站采用Blast软件作同源性比较。1.2激光扫描共聚焦显微镜观察金黄色葡萄球菌生物膜形成过程采用六孔板培养,盖玻片上形成生物膜,分别于接种2h、4h、8h、12h、16h、24h和48h后取出玻片,采用FITC-ConA和碘化丙啶(PI)分别标记多糖和细菌DNA,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察生物膜形成情况。1.3金黄色葡萄球菌生物膜形成过程中alpha-毒素的表达分析分别在细菌接种后4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h和48h采用三氯乙酸(TCA)沉淀法提取培养液中的细菌分泌蛋白,进行SDS-PAGE电泳后,将蛋白转至NC膜,然后以兔抗金葡菌alpha-毒素抗体作为第一抗体,羊抗兔IgG为第二抗体进行蛋白质免疫印迹检测(western blot) alpha-毒素的表达,结果采用Image-pro-plus5.0软件分析,并将分析结果用Office2003-Excel作图。2.结果2.1金黄色葡萄球菌生物膜形成检测与alpha-毒素编码基因hla的PCR分析在无外界因素干扰的条件下,本研究所选用的临床分离金黄色葡萄球菌中70%(14/20)可形成肉眼可见的生物膜,其中以X321、X389和X428等3株最为明显;20株金黄色葡萄球菌均能扩增出目的基因片段。选用可形成明显生物膜的菌株X428的PCR产物测序并进行Blast序列比对分析,结果显示与Genebank网站上注册号为CP000255的金黄色葡萄球菌hla序列99%同源。2.2激光扫描共聚焦显微镜观察金黄色葡萄球菌生物膜形成过程。通过激光扫描共聚焦显微镜对金黄色葡萄球菌生物膜形成进行观察,取得了一系列生物膜CLSM水平断层图像,2h仅有少量单个的细菌粘附于盖玻片;4h细菌粘附形成由4-6个细菌组成的小菌落;8h细菌聚集成簇,但FITC-ConA单染效果无多糖成份产生;12h细菌菌落增大,多糖基质产生;16h形成相对成熟的生物膜结构,细菌被包被于多糖基质中;24h和48h可见生物膜结构变小,数量减少。2.3生物膜形成不同阶段alpha-毒素表达分析从接种后4h到16h,alpha-毒素表达量逐渐增加,成熟的生物膜结构形成后,表达量虽然减少但仍维持于高水平。3.结论3.1在本研究培养条件下70%临床分离金黄色葡萄球菌菌株(14/20)形成了肉眼可见的生物膜,表明大部分医院感染的金黄色葡萄球菌可以形成生物膜。3.2采用免疫荧光技术和激光扫描共聚焦显微镜技术研究生物膜形成过程是一种简便可行的方法;在本研究中,接种后前4h细菌处于粘附阶段,4h-12h处于聚集阶段,12h-16h为分化成熟阶段。多糖基质产生并逐渐增多,直至16h形成相对成熟的生物膜结构,16h后随着营养成份的不断消耗,生物膜开始播散。3.3 Alpha-毒素在金黄色葡萄球菌生物膜形成的粘附阶段即开始表达且表达量逐渐增加,在播散阶段表达量趋于减少,但直到接种48h后,仍维持于一个较高水平。因此,alpha-毒素可能与金黄色葡萄球菌生物膜形成有关,我们推测其自身可能介导细菌与表面的粘附和(或)细菌间的粘附,也可能通过诱导其他生物膜基质成份形成而发挥作用。