论文部分内容阅读
研究背景:子宫内膜癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤。根据2015年公布的统计数据,全球范围内,子宫内膜癌新发病例为319,600,位居女性恶性肿瘤第六位,并且在经济发达国家,发病率高达第四位。随着我国经济水平的上升,患有高血压、肥胖、糖尿病和高脂血症等子宫内膜癌高危因素的女性人数显著增加,该病发病率呈逐年递增趋势。子宫内膜癌分为两型(I型和II型),其中I型即雌激素依赖型子宫内膜癌为子宫内膜癌中最常见类型(80%),且发病呈年轻化趋势,如何明确I型子宫内膜癌发生发展的分子机制并寻求精准预测、早期诊断和早期治疗的靶体分子是当前研究的热点和重点。由于I型子宫内膜癌为激素依赖性肿瘤,常存在多种代谢通路异常,因此已描述生物体代谢变化规律的“代谢组学”为实现这一目标提供了实验基础。代谢组学一方面对内源性代谢物整体及其动态变化规律进行检测、量化,并寻找有效的内源性小分子标志物(核酸、氨基酸、脂肪酸、糖类等),作为疾病诊断及个体化治疗监测的依据;另一方面确定该变化规律与生物过程的有机联系,从而揭示疾病的发生发展机理,使人们对肿瘤细胞的生命活动有了更深层次的理解,为肿瘤的研究提供了一个新的角度,并显示出了巨大潜力。目的:运用以GC-TOF-MS平台为基础的非靶标代谢组学方法探索I型子宫内膜癌与疾病对照组患者体液(血清和尿液)的差异性代谢物,将差异代谢物映射相关数据库,寻找潜在差异性代谢通路,并在子宫内膜样癌癌组织及癌旁组织中对部分已筛选的差异性代谢物进行GC-Q-MS及UHPLC-MS/MS靶标验证,探索子宫内膜样癌可能的发生机制并为寻求早期诊断和分层治疗提供理论基础和科学依据。方法:按纳入和排除标准选取30例I型子宫内膜癌患者及31例因子宫良性疾病而入院的对照组患者,每位患者留取血清和尿液若干份,子宫内膜样癌患者术中留取癌组织及癌旁组织各若干份,样品经BSTFA(withl%TMCS,v/v)衍生化后,采用GC-TOF-MS分析平台对体液样本进行非靶标代谢物检测和鉴定,经多元变量模式识别分析(主成分分析PCA和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA)和数据建模,筛选差异性代谢物,同时映射KEGG数据库行代谢通路及层次聚类分析,寻找相关差异性代谢通路;并在组织样本中以GC-Q-MS及UHPLC-MS/MS平台进行靶标验证,以确定差异性代谢物及相应代谢通路。结果:本实验中血清GC-TOF-MS非靶标代谢组学分析共筛选出354个峰值,经原始数据预处理保留其中274个峰值,经多元变量模式分析共确定29种差异性代谢产物,其中丙氨酸、亚氨基二醋酸、尿嘧啶、d-葡庚酸、草酰乙酸、N-乙酰基-D-氨基半乳糖、丙二酰胺、N,N-二甲基精氨酸、N-乙酰色氨酸共9种化合物在子宫内膜样癌患者血清中含量升高,差异具有显著性;软脂酸、3-羟丁酸、亚油酸、棕榈油酸、谷氨酰胺、十七(烷)酸、牛磺酸、2-丁酮酸、肉豆蔻酸、腐胺、反式-3,5-二甲氧基-4-羟基桂皮醛、N-乙酰基-5-羟色胺、双(2-羟丙基)胺、N-乙酰基-L-亮氨酸、5-羟基吲哚-2-羟酸、5-羟色氨酸、N(E)-三甲基赖氨酸、酒石酸、环已胺、L-半胱氨酸共20种化合物在子宫内膜样癌患者血清中含量降低,差异具有显著性。最终代谢通路分析结果示脂肪酸合成代谢、柠檬酸循环、泛酸和辅酶A生物合成、乙醛酸盐和二甲酸亚乙基酯代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、亚麻仁油酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢改变在子宫内膜样癌患者血清GC-TOF-M S非靶标代谢组学分析中具有重要作用。尿液GC-TOF-MS非靶标代谢组学分析共筛选出477个峰值,经原始数据预处理保留其中299个峰值,共鉴定出差异性代谢物共29种,其中7种小分子代谢物尿液中含量明显升高(肌酸、蔗糖、磷酸盐、乳糖醛酸、去甲肾上腺素、DL-二氢鞘氨醇、N-乙酰基-β-丙氨酸),22种化合物含量降低(岩藻糖、尿嘧啶、D-半乳糖醛酸、葡糖二酸、3-氨基异丁酸、黄嘌呤、L-半胱氨酸、胍基琥珀酸、L-苹果酸、2-羟基戊酸、富马酸、嘌呤核糖核苷、1,5-脱水葡糖醇、槐二糖、乳糖醛酸、肌苷、1-蔗果三糖、草氨酸、苯甲氧甲酰基-L-亮氨酸、3,5-二羟苯甘氨酸、5,6-二甲基苯并咪唑、戊烯二酸),差异均具有显著性。最终代谢通路分析结果示柠檬酸循环、泛酸和辅酶A生物合成、β-丙氨酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢改变在子宫内膜样癌患者尿液GC-TOF-MS非靶标代谢组学分析中具有重要作用。根据患者血清和尿液差异性代谢物的GC-TOF-MS非靶标分析结果并结合文献子宫内膜样癌组织中的非靶标代谢物分析结果,共挑选出6种相关联的小分子化合物(软脂酸、L-半胱氨酸、尿嘧啶、牛磺酸、亚油酸及肌苷),并进一步在子宫内膜样癌癌组织及癌旁组织中进行靶标代谢组学验证。由于6种小分子化合物理化性质不同,分别采用GC-Q-MS及UHPLC-MS/MS靶标代谢组学研究方法,结果显示尿嘧啶、L-半胱氨酸及牛磺酸的含量改变在相对应的癌及癌旁组织中差异具有显著性(p<0.05),该研究结果为下一阶段的代谢物分子通路和功能研究提供笃实的实验依据。结论:1.针对I型子宫内膜癌的血清和尿液,行GC-TOF-MS非靶标代谢组学分析,肿瘤组与疾病对照组间筛选出共56种差异性代谢产物(血清和尿液各29种,其中尿嘧啶和L-半胱氨酸为共同差异表达),并行KEGG最终代谢通路分析。2.采用GC-Q-MS及UHPLC-MS/MS的代谢组学研究方法对筛选出的血清和尿液部分的差异性代谢物进行靶标验证,结果证实尿嘧啶、L-半胱氨酸及牛磺酸的含量改变在癌及癌旁组织中差异具有显著性,推测尿嘧啶、L-半胱氨酸及牛磺酸相关代谢途径及通路在子宫内膜样癌的疾病发生发展中可能具有重要作用。