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原发性肝癌,尤其是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上致死率较高的癌症之一。肝癌的发病率在亚洲和非洲较高,在我国它是致死率第二高的肿瘤。肝癌转移是一个复杂的、多步骤的过程,是引起肝癌患者死亡的重要因素之一,研究肝癌发生转移的分子机制对于肝癌的诊断和治疗具有重要意义。本研究以来源于同一母系细胞、具有不同转移潜能的三株细胞系——MHCC-97L、MHCC-97H和HCC-LM3为研究模型,对差异表达的微小RNA(microRNA,miRNA)进行鉴定,以期得到与肝癌细胞转移相关的miRNA。通过芯片筛选得到27个表达逐渐改变的miRNA分子,其中19个miRNA随细胞转移潜能增加而逐渐上调,8个随细胞转移潜能增加而逐渐下调。首先,我们分析了8个逐渐下调的miRNA在TCGA肝癌组织数据库中的表达情况,得到6个改变趋势一致的miRNA:miR-489,miR-30e-3p,miR-194-3p,miR-200a-3p,miR-192和miR-574-3p。结合文献报道、细胞迁移实验和real-time PCR验证,选择miR-192进一步深入研究。TCGA数据库显示miR-192在肝癌组织中的表达显著低于相应的癌旁组织,且miR-192和肿瘤的血管侵犯呈负相关,提示miR-192可能与肝癌的转移相关。体外细胞迁移和侵袭实验发现miR-192显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。而原位接种肝癌细胞到裸鼠的肝脏显示miR-192过表达也可抑制肝癌细胞体内转移。进一步研究miR-192的作用机制发现,SLC39A6(solute carrier family 39,member 6)为miR-192的直接靶基因。干扰SLC39A6在肝癌细胞中的表达能够显著抑制细胞的侵袭和迁移;而过表达SLC39A6能够促进肝癌细胞的侵袭和迁移。并且,SLC39A6在miR-192稳定表达的细胞中的过表达能够部分回复miR-192对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。另外,我们还发现miR-192的上调会导致Snail表达下调和E-cadherin上调;而干扰SLC39A6的表达,Snail和E-cadherin也会发生类似的改变。GSK-3抑制剂处理miR-192过量表达的细胞能够使细胞的迁移和侵袭能力部分恢复。miR-192能够通过SLC39A6下调GSK-3β-Ser9的磷酸化水平,SLC39A6的表达部分回复了GSK-3β-Ser9的磷酸化水平。本实验室的肝癌组织样本和TCGA数据库分析显示miR-192表达与病人预后相关:miR-192高表达的病人总生存率更高。由此,我们得出结论:miR-192通过直接靶向SLC39A6参与GSK-3β/Snail/E-cadherin信号通路抑制肝癌转移,并与肝癌病人的总生存率相关。另外,我们分析了19个逐渐上调的miRNA,选择本底表达水平较高且未被报道过肝癌转移相关功能的miR-99a进行研究。通过体内外实验发现,miR-99a显著的促进肝癌细胞侵袭和转移。通过TargetScan预测和表达谱芯片整合分析,我们得到了6个候选的miR-99a靶基因。进一步进行功能实验和双荧光素报告酶实验确定CTDSPL(carboxy-terminal domainsmall phosphatase-like)为miR-99a的直接靶基因。CTDSPL可抑制肝癌细胞的迁移,并且CTDSPL的过表达能够部分回复miR-99a对肝癌细胞迁移的促进作用。CTDSPL是一个磷酸酯酶,我们发现Smad1的两个磷酸化形式,Ser463/465和Ser206都因为CTDSPL的过表达下调。相反地,miR-99a的过表达则上调了Smad1-Ser463/465和Smad1-Ser206的磷酸化水平。Smad1的下游分子BMP2和ID3的表达也因为miR-99a的过表达而表达上调。因此,miR-99a通过CTDSPL调节Smad1介导的信号通路,从而促进肝癌细胞的转移。本研究针对转移这一肝癌进展中关键的步骤进行了研究,发现了可以抑制转移的miR-192和促进转移的miR-99a,并研究它们发挥作用的分子机制。本研究为阐明肝癌转移的分子机制提供了新的线索,为肝癌的治疗提供了新的方向。