帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是发生于中枢神经系统常见的退行性疾病。目前认为PD的主要病因可能是遗传变异、环境因素、氧化胁迫、线粒体功能障碍、异常蛋白高表达与聚集、蛋白降解功能障碍、年龄老化等。鱼藤酮(rotenone,Rot)是一种广泛使用的杀虫剂和杀鱼剂,能够抑制线粒体复合酶I的活性。流行病学调查发现人类长期接触Rot与罹患PD相关。葡萄籽原花青素(grape seeds procyanidins,GSP)为葡萄籽中提取的多酚化合物,相关研究证实,其有明显的抗氧化、抗炎等作用;番茄红素(lycopene,Lyc)是一种抗氧化性很强的天然类胡萝卜素,具有清除自由基的功效。PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,广泛用于神经系统疾病的体外研究。本实验旨在借助现代细胞学技术,检测GSP、Lyc对Rot诱导的PC12细胞损伤的保护作用,以期从微观角度了解其作用机制,从而为帕金森症的防治提供一定的研究基础。本文建立了Rot染毒PC12细胞株作为帕金森病细胞模型,以GSP和Lyc分别作为保护剂,研究了其对Rot所致PC12细胞损伤的保护作用及可能的机制。结果如下:1.台盼蓝排染法及MTT法检测细胞毒性结果显示:Rot对PC12细胞具有明显的生长抑制作用,存在剂量-时间效应。GSP在10μg/m L浓度下对细胞没有毒性,并在10μg/m L的保护浓度下可以抑制Rot引起的细胞生长率降低;Lyc在5μM浓度下对细胞没有毒性,在5μM的浓度下表现出对Rot所致PC12细胞生长率降低的抑制作用。2.倒置显微镜形态观察结果显示:Rot可以引起PC12细胞形态发生改变,细胞胞体收缩变圆、部分细胞失去贴壁能力。而用GSP、Lyc分别预保护后,这些特征均有一定的缓解。3.吉姆萨染色、Hoechst 33342荧光染色实验结果显示:Rot作用后,PC12细胞核出现核碎裂、染色质凝集现象,表现出明显的凋亡性特征,GSP、Lyc分别预保护后凋亡特征有所缓解。4.毛细管电泳结果显示:与对照组相比,Rot单独处理组细胞内8-OHd G含量增高,说明Rot对PC12胞内DNA具有损伤作用,而在GSP、Lyc的保护下,胞内8-OHd G含量降低,说明保护剂抑制了Rot对细胞DNA的损伤。5.Thioflavine S染色法观察胞内异常蛋白聚集的结果显示:与对照组相比,Rot单独处理组细胞内荧光增强,说明胞内出现异常蛋白的聚集,而在GSP、Lyc的保护下,胞内荧光减弱,说明保护剂对异常蛋白的聚集具有抑制作用。6.DCFH-DA、Rhodamine 123染色后经荧光显微镜观察及流式细胞术检测其胞内ROS和MMP水平的变化情况,结果显示:Rot处理细胞3 h、6 h、12 h后,细胞内ROS含量与对照相比均升高,在3 h时最高;Rot处理细胞6 h、12 h、24 h后,MMP水平与对照相比均降低,并随着时间延长而持续下降,在24 h降至最低水平。GSP、Lyc的加入可以抑制Rot引起的细胞内ROS含量升高、MMP水平的降低。7.Annexin V/PI双染分析结果显示,Rot引起细胞磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞膜通透性改变,出现了早期和晚期凋亡,经GSP、Lyc分别预保护后,细胞凋亡率有所降低。本研究中多个指标显示,GSP、Lyc在Rot诱导的PC12细胞凋亡模型中通过降低ROS生成、提高线粒体膜电位水平、抑制DNA损伤、抑制细胞内异常蛋白的聚集,以达到抑制Rot引起的细胞凋亡,具有防治帕金森病的潜质。