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玉米胚乳是重要的养分贮藏器官,以玉米胚乳为原料提取的玉米淀粉具有极佳的纯度与品质,是重要的粮食、饲料、工业、医疗原料。支链淀粉在玉米籽粒淀粉中所占比例较高,可高达70%以上,因此研究玉米淀粉生物合成的机理,尤其是支链淀粉的生物合成途径,对提高玉米淀粉品质具有重要的意义,能够为提高玉米淀粉的产量与品质、培育优良种质提供理论依据。淀粉的生物合成是多酶协同完成的过程,淀粉合酶（Starch Synthase,SS）是催化多聚糖侧链延伸的一类酶。淀粉合酶I（Starch Synthase I,SSI）是SS中的一种重要同工型,直接参与支链淀粉的合成,影响团粒淀粉的形态。玉米淀粉质体型磷酸化酶（Starch Phosphorylase Low-affinity type,PHOL）,能够直接或间接影响淀粉的品质,参与籽粒淀粉多个阶段的合成、修饰,包括支链淀粉的初始合成。随着研究手段的不断更新与完善,大麦、水稻、玉米中SS同工型的生化特性不断有更新报道;水稻、大麦PHOL的最新研究表明PHOL与支链淀粉初始合成密切相关。研究SSI、PHOL的生化特性,一方面能够解析支链淀粉合成机理,更好地认识团粒淀粉形态结构影响因素,另一方能够为改良玉米籽粒淀粉、培育优良品种提供理论基础。1.本研究针对ZmSSI的底物饱和性与偏好性、侧链延伸特性三个方面的酶学特性进行研究;针对特异插入结构域L80对ZmPHOL的分解与蛋白互作的影响进行了研究,主要成果如下:为了研究SSI的底物特性,本研究参考植物中多聚糖分布情况,设置了不同浓度的麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖为受体底物,测试ZmSSI对不同链长、不同浓度麦芽糊精的酶活力曲线、米氏常数,发现ZmSSI的酶活力曲线不具有平台效应,说明ZmSSI对底物无饱和性;不同受体底物下SSI对底物ADP-G的Km（ADP-G）有差异,说明SSI具有受体底物偏好性,偏好糖原、长链MOS作为受体底物。2.通过薄层色谱（Thin layer Chromatography,TLC）、以及高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测Zm SSI催化不同受体底物侧链延伸产物的链长与分布情况,确定ZmSSI能够延伸出长达25个葡聚糖单位的侧链,催化链长产物的分布情况与前人报道类似,产物以中短链为主。电喷雾-串联质谱检测（ESI-Mass Spectral,ESI-MS/MS）以[13C]ADP-Glucose为葡萄糖供体的ZmSSI催化产物,鉴定ZmSSI仅在麦芽糊精的非还原端进行链长催化。对SSIII-HD-SSI复合体进行初步研究,发现SSIII-HD的结合对Zm SSI的酶活力、底物亲和性以及侧链延伸性质均无显著影响。3.生物信息学分析表明,ZmPHOL能够形成同源二聚体,L80结构域位于ZmPHOL蛋白构象外侧,呈灵活的环状结构;L80插入结构中有7个丝氨酸磷酸化位点、一个蛋白酶解区PEST,并且有两个预测的磷酸化位点Ser430和Ser431位于PEST中;ZmPHOL的蛋白互作预测显示PHOL具有6种未报道的蛋白互作方式。生物信息学预测表明,L80可调节ZmPHOL的分解,与蛋白互作相关,L80对ZmPHOL的调节可能受到Ser430、Ser431特异磷酸化位点的影响。4.利用融合蛋白PHOL、PHOM（缺失L80的PHOL）PHOL-S430A（PHOL中Ser430突变为Ala）PHOL-S431A（PHOL中Ser431突变为Ala）进行体外分解实验,特异抗体Anti-1、Anti-2对分解产物作WB检测,发现PHOL与点突变的蛋白均表现出不同程度的降解,缺失了L80的PHOM表现出较好的稳定性。说明PHOL的分解发生在L80结构域,Ser430、Ser431直接影响PHOL的分解。PHOL在相同温度无ATP、造粉体裂解液的处理中表现出良好的稳定性,说明PHOL的分解需要ATP与造粉体中酶的催化。5.已知PHOL能够与诸如淀粉分支酶IIb（starch branching enzyme IIb,SBEIIb）、淀粉合成酶IIa（starch synthase IIa）依靠蛋白磷酸化形成多酶复合体。本研究利用蛋白体外结合（Pull-down）联合蛋白凝胶质谱,检测PHOL、PHOM、PHOL-S430A和PHOL-S431A从造粉体裂解液中钓取的蛋白,发现了与PHOL特异结合且基因时空表达与Zmphol存在重叠的6种蛋白;比较PHOL与PHOM、PHOL-S430A、PHOL-S431A结合的差异,发现PHOL蛋白互作发生在L80,PHOL蛋白复合体的形成受到Ser430、Ser431两个位点的直接影响。本研究已经探明SSI对于不同链长的受体底物不具有受体底物饱和性,偏好于糖原、长链MOS作为受体底物;SSI仅在α-多聚葡萄糖的非还原端进行糖链的延伸,能够延伸到长达25个葡萄糖单位的侧链,不仅催化生成短链;L80能够直接影响PHOL的热稳定性,是直接参与PHOL蛋白互作的区域,L80中的两个特异磷酸化氨基酸残基Ser430,Ser431能够直接影响PHOL的热稳定性与蛋白互作。本研究鉴定的SSI受体底物饱和性、偏好性以及延伸特性,为SS在上述三方面的酶学共性研究提供了理论基础,能够帮助研究者更好地理解玉米淀粉高效合成机制,对解释SS、SBE等玉米淀粉合成酶相互调节机制提出了新的研究思路。本研究鉴定了L80以及Ser430、Ser431能够直接影响PHOL的降解、蛋白互作,能够一定程度上解析L80插入结构域以及特异磷酸化位点对PHOL结构稳定、翻译后修饰上的影响,为后续关于PHOL高温下降解、催化活力以及多酶复合体的生物学功能提供理论基础以及新的研究思路。初步筛选出的PHOL结合蛋白还需要诸如酵母双杂交、BiFC等体内外的实验进行进一步验证;解析PHOL与14-3-3、BT1等蛋白互作的生物学意义,能够进一步认识PHOL在淀粉合成途径中发挥的作用。