哈维氏弧菌(Vbrio harveyi)是海水养殖中常见的革兰氏阴性致病菌，其细胞表面特有的外膜蛋白(outer membrane proteins， Omps)在维持细菌细胞结构稳定、物质交换及细菌的致病过程中起着十分重要的作用，并且部分种类如OmpK等具有良好的免疫原性。弧菌外膜蛋白OmpK是一种宽宿主的噬菌体KVP-40受体，其广泛存在于各种弧菌之中，是弧菌细胞表面一种组成性蛋白，具有与外界广泛接触的机会，很有可能是弧菌的表面抗原之一。　　 根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK的基因序列(登录号为AY332563)设计1对特异性引物，以哈维氏弧菌基因组DNA为模板通过PCR的方法扩增获得OmpK成熟肽基因片段，大小约为750bp，构建克隆载体pMD18T-OmpK，测序结果表明，该基因与已发表的哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因序列存在99％的同源性，初步表明成功克隆了OmpK成熟肽基因片段，且该序列在GenBank上的登录号为HQ395754。重组质粒pMD18T-OmpK经BamHⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶双酶切后回收OmpK基因片段，并将此基因亚克隆至质粒pET30a，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，构建了原核表达工程菌Ecoli/pET30a-OmpK，重组菌在IPTG的诱导下以包涵体的方式大量表达重组蛋白，重组蛋白分子量大小约为33kD，包涵体经EDTA、Triton、低浓度尿素等反复洗涤后，溶解至高浓度的尿素中，最后通过透析的方法使重组蛋白复性，复性的重组蛋白免疫新西兰兔制备了兔多抗OmpK血清。　　 以已构建好的表达载体pET30a-OmpK为模板，根据pPIC9K分泌表达载体的特征设计一对特异性引物，通过PCR的方法扩增得成熟肽基因片段，然后连入pPIC9K质粒构建了重组表达载体pPIC9K-OmpK，重组质粒经菌落PCR、质粒双酶切以及测序鉴定，结果表明构建成功。大量抽提重组质粒pPIC9K-OmpK和亲本质粒pPIC9K，经SacⅠ线性化后通过电转的方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中。重组转化子GS115/pPIC9K-OmpK和GS115/pPIC9K经遗传霉素筛选获得了抗4.0mg/mL G418的高拷贝子；经MM/MD平板鉴定发现转化子大多为Mut+；经菌落PCR鉴定发现目的基因成功整合入毕赤酵母基因组中。阳性转化子在甲醇的诱导作用下分泌表达重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为37KD且被过度糖基化。重组蛋白经Western-Blot鉴定发现其能与原核表达的兔多抗OmpK包涵体血清发生反应，说明重组蛋白成功表达且其免疫原性不受影响。　　 以表达载体pET30a-OmpK为模板，根据pPIC3.5K胞内表达载体的特征设计一对特异性引物，通过PCR方法扩增得OmpK成熟肽基因片段，然后连入pPIC3.5K质粒构建了穿梭载体pPIC3.5K-OmpK，SalⅠ线性化重组质粒pPIC3.5K-OmpK和亲本质粒pPIC3.5K后以氯化锂法转入毕赤酵母GS115，转化子经遗传霉素筛选抗2.0mg/mL G418的高拷贝子，经MM/MD平板鉴定其表型，随后抽提转化子的基因组DNA，以两对引物对其进行反复鉴定，结果表明成功构建了酵母阳性转化子GS115/pPIC3.5K-OmpK和GS115/pPIC3.5K，阳性转化子经甲醇的诱导后胞内表达重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为28.7KD，经酸洗玻璃珠法发现重组蛋白在胞内以包涵体的方式进行表达，Western-Blot鉴定发现其能与兔多抗OmpK包涵体血清发生反应，表明重组蛋白在胞内成功表达。