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研究背景随着新型抗生素和疫苗的发展及其在临床上的应用,感染性疾病的治疗已取得巨大成功,但是在过去的几十年中,过敏性疾病却呈现出明显上升趋势。食物过敏的症状轻则仅表现为轻度不适,如进食过敏食物后出现呕吐、腹痛、腹泻,严重者会发热、呕血、便血,甚至出现威胁生命的过敏性休克。人类肠道致敏的初始过程仍不清楚,可能同时暴露于微生物感染和食物抗原协同作用使静息型T细胞分化为抗原特异性Th2型T细胞,随后损害免疫耐受而导致肠道致敏。相关报道提示益生菌具有调控免疫反应的功能。Fuller证实摄入益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌与预防各种过敏性疾病有关。研究显示益生菌在人和小鼠模型上均表现出抗过敏的作用。由于益生菌所独有的生物学特点和肠道黏膜免疫反应的特异性,使肠道益生菌疗法作为一种治疗食物过敏的新疗法日益受到重视。在种类繁多的益生菌中,双歧杆菌作为人类肠道的原籍菌群,极具研究价值。金黄色葡萄球菌通常存在于人体肠道内,许多证据表明金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)与过敏性疾病的发病有关。SEB被用作有代表性的微生物产物;卵清蛋白(ovalbumin,OVA)因具有可靠的抗原性而被认为是一种理想的食物抗原模型,经常用于研究食物过敏症和食物抗原相关性炎症。本研究选用SEB+OVA共同作用于BALB/c小鼠构建动物模型,采用双歧杆菌进行干预,探讨益生菌在改善食物过敏动物肠道屏障功能、调整肠道菌群结构以及对Th1/Th2免疫反应调节方面的作用及其机制。另外,思密达是临床常用的治疗腹泻的肠道黏膜保护剂,我们将思密达和双歧杆菌联合使用,以研究两者在保护肠道黏膜屏障功能方面有无协同作用。目的使用SEB和OVA共同作用于BALB/c小鼠,通过测定小鼠的肠道菌群、血清二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)活性、来评价其肠道屏障功能变化,研究有无细菌移位现象发生;同时观察其脾脏细胞中CD4+CD25+Treg细胞数量和血清中Th1/Th2细胞因子的变化。使用双歧杆菌进行干预,探讨益生菌在改善食物过敏动物肠道屏障功能、调整肠道菌群结构以及对免疫功能调节方面的作用及其机制。方法无受试蛋白喂养BALB/c小鼠40只,随机分为4组:各组分别于第0、3、9日腹腔注射生理盐水、SEB、OVA、SEB+OVA;并于第7、14日给予OVA灌胃。在SEB+OVA实验组的基础上设立模型对照组、双歧杆菌作用组、思密达作用组、双歧杆菌+思密达共同作用组,第15日开始分别经灌胃给予不同的药物,连续7日,1次/日。小鼠腹泻为造模成功标志,如果被致敏小鼠未出现明显腹泻,可观察处死后小鼠的肠道内容物,相对于正常小鼠结肠中的球样大便,水样粪便亦可被视为腹泻。造模或双歧杆菌干预后进行相关指标的检测。1.ELISA法测定小鼠血清中总IgE水平。2.取小鼠新鲜粪便利用选择性培养基培养大肠杆菌、类杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌并进行菌群定量分析。3.ELISA法测定小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-10、IL-13及INF-γ的含量。4.分光光度计法测定小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)含量。5.无菌取肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)、肝脏、肾脏、肺脏组织进行培养以检测有无细菌移位的发生。6.流式细胞仪测定小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞的数量。所得数据均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。组间均值比较采用单因素方差分析,细菌移位率的比较采用行×列表x2检验。以a=0.05为假设检验标准。结果1.正常对照组小鼠的IgE(A值)为0.426±0.249,SEB+OVA实验组的IgE为0.634±0.220,SEB+OVA实验组较其他三组对照的IgE水平明显升高,与正常对照组相比组间差异有统计学意义(P=0.044),食物过敏模型小鼠血清总IgE增高,证明了使用这种方法成功的诱导了小鼠食物过敏。双歧杆菌治疗后,血清总IgE为0.440±0.126,与实验组相比明显下降(P=0.035)。2.正常对照组小鼠的平均DAO(A值)为0.145±0.094,SEB+OVA实验组的平均DAO为0.385±0.186,SEB+OVA实验组较其他三组对照的平均DAO明显升高,与正常对照组相比组间差异有统计学意义(P=0.000),经双歧杆菌治疗后,血清DAO含量为0.157±0.071,与实验组相比明显下降(P=0.035);双歧杆菌+思密达组DAO水平与双歧杆菌组无差异。DAO是一种具有高度活性的细胞内酶,存在于哺乳类动物的黏膜或绒毛上层,当小肠黏膜机械屏障受损导致通透性增高时,DAO将释放入血导致外周血中DAO含量升高。致敏组小鼠肠道通透性增高,经双歧杆菌治疗后,肠道通透性下降。3.脾脏单个核细胞悬液CD4+CD25+Treg细胞:流式细胞仪测定各组小鼠CD4+CD25+T细胞占脾脏单个核细胞的百分比,SEB+OVA实验组较其他三组对照的CD4+CD25+Treg细胞水平明显降低,与正常对照组相比组间差异有统计学意义(4.216%±0.439%vs 5.969%±0.469%,P=0.000)。经双歧杆菌治疗后CD4+CD25+Treg细胞水平明显升高(5.778%±0.773%vs 4.216%±0.439%,P=0.000);双歧杆菌+思密达组CD4+CD25+Treg细胞水平与双歧杆菌组无差异。提示CD4+CD25+Treg细胞的下降有可能打破口服耐受或诱导口服耐受失败,诱发食物过敏。使用双歧杆菌对过敏小鼠进行干预后,脾脏CD4+CD25+Treg细胞数量增多,提示双歧杆菌可以通过增加调节性T细胞数量,纠正失衡的Th1/Th2反应,治疗食物过敏。4.Th1/Th2测定:正常对照组小鼠血清的IL-4(pg/mL)为45.877±2.804,SEB+OVA实验组的IL-4为69.980±9.103,SEB+OVA实验组较其他三组对照的IL-4水平明显升高,与正常对照组相比组间差异有统计学意义(P=0.000),经双歧杆菌治疗后,血清IL-4含量为51.314±3.785,与SEB+OVA组相比明显下降(P=0.000)。正常对照组小鼠INF-γ(pg/mL)为204.018±32.031,SEB+OVA实验组的INF-γ为133.875±33.822,SEB+OVA实验组较其他三组对照的INF-γ水平明显下降,与正常对照组相比组间差异有统计学意义(P=0.000);经双歧杆菌治疗后,血清INF-γ含量为194.281±12.144,与SEB+OVA实验组相比明显升高(P=0.000);双歧杆菌+思密达组IL-4、INF-γ水平与双歧杆菌组无差异。血清IL-5、IL-13水平与IL-4有着相似的变化趋势;而IL-10水平在小鼠致敏后升高(95.223±21.816 vs 59.967±15.524,P=0.000),经双歧杆菌治疗之后出现再次升高(110.025±11.952 vs 95.223±21.816,P=0.000)。表明食物过敏以Th2型反应占优势,双歧杆菌可以下调上扬的Th2细胞因子,纠正Th1/Th2失衡,治疗食物过敏。5.SEB+OVA实验组小鼠大肠杆菌含量(Log10CFU/g)(6.718±0.267 vs 5.368±0.329,P=0.000)和类杆菌(8.606±0.317 vs 7.518±0.326,P=0.000)较正常对照组明显升高;SEB+OVA实验组双歧杆菌的含量(Log10CFU/g)(7.491±0.339 vs8.706±0.153,P=0.000)和乳酸杆菌(5.654±0.289 vs 6.649±0.231,P=0.000)较正常对照组明显下降;经双歧杆菌治疗后,大肠杆菌含量为5.364±0.537,类杆菌为7.427±0.544,与实验组相比均明显降低(P=0.000,P=0.000);双歧杆菌含量为8.611±0.295,乳酸杆菌含量为6.670±0.443,与实验组相比均明显回升(P=0.000,P=0.000);双歧杆菌+思密达组大肠杆菌、类杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌的含量水平与双歧杆菌作用组无明显差异。食物过敏小鼠肠道内菌群结构发生明显改变,条件致病菌大肠杆菌、类杆菌的数量高于正常对照组小鼠,益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌数量的则明显减少。经双歧杆菌治疗后,肠道内条件致病菌数量下降,益生菌的数量明显增多。提示双歧杆菌可促进过敏小鼠肠道的双歧杆菌、乳酸杆菌增殖,抑制条件致病菌大肠杆菌、类杆菌等的生长,具有调节肠道菌群的能力。6.MLN及肝脏、肺脏、肾脏细菌培养显示SEB+OVA实验组与对照组小鼠均有细菌移位现象发生,但实验组细菌移位率显著高于正常对照组(37.5%vs7.5%,P=0.001);双歧杆菌及治疗后,细菌移位率明显降低(12.5%vs 37.5%,P=0.001);双歧杆菌+思密达组细菌移位率与双歧杆菌组无差异。证实了食物过敏过程中细菌移位的存在,而MLN更易发生细菌移位。本实验同时表明,双歧杆菌能有效治疗细菌移位的发生发展,提示双歧杆菌能帮助机体清除细菌及毒素。结论1.本研究使用SEB+OVA能够有效诱导小鼠发生食物过敏,成功构建了一种新的食物过敏动物模型。2.SEB+OVA肠道致敏小鼠粪便菌群失调,条件致病菌大肠杆菌及类杆菌的数量显著增高,益生菌双歧杆菌及乳酸杆菌的数量则显著降低;致敏小鼠肠道屏障功能障碍,存在肠道细菌移位现象。3.在小鼠食物过敏的发生发展过程中CD4+CD25+Treg细胞的下调发挥重要作用。4.双歧杆菌能够有效调节过敏小鼠肠道菌群,增强肠道粘膜屏障功能,调节过敏小鼠的免疫功能,纠正Th1/Th2失衡,提高CD4+CD25+T细胞数量,治疗食物过敏。