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目的母胎免疫耐受模型——自然界中我们可以借鉴的一个天然的移植免疫耐受模型。由于正常妊娠与移植耐受机制有一定的相似性,而小鼠在妊娠期间调节性T细胞的数量有明显的增加,功能也具有一定的特殊性,本实验试图通过分离纯化孕鼠体内调节性T细胞(以下简称piTreg),在体外刺激高纯度piTreg的扩增;并验证piTreg扩增后表达上的变化。此外,采用细胞共培养抑制试验的方法,以期初步评价Treg、piTreg和ex-Treg(体外扩增后Treg)对na(l|¨)ve T细胞增殖抑制率的区别。实验方法采用清洁级健康雌性小鼠C57/BL6(H2K~b),雄性小鼠BALB/c(H2K~d),体重均为18～23g。将C57/BL6雌性小鼠与BALB/c雄性小鼠同笼受孕。在孕0、7、12、16、20天数处死母鼠,并取少量非孕鼠做对照,提取脾脏单个核细胞。用流式仪分析孕不同时间piTreg在单个核细胞中的表达情况,确定piTreg(Treg)表达的动态变化;以及FoxP3在piTreg中的表达情况。用流式细胞分选仪分选piTreg(Treg),确保纯度在90%以上。再将含高浓度的rhIL-2和anti-CD3/CD28的扩增培养基,刺激分选后的Treg、piTreg、Na(l|¨)ve T细胞和CD4~+CD25~-T细胞增殖,比较扩增情况;另将na(l|¨)ve T细胞进行CFSE染色,观察激活后T细胞增长规律。将分选获得的高纯度piTreg、Treg细胞和ex-Treg作为抑制细胞,分别与CFSE染色的效应细胞(na(l|¨)ve T细胞)和刺激细胞(CD4~-T细胞)进行共培养,用ModFit软件分析效应细胞增殖指数,以比较各组抑制细胞的抑制效率。统计分析用SPSS16.0统计软件完成。结果小鼠Treg占脾脏单个核细胞的1～2%,而piTreg占脾脏单个核细胞的比例＞2%;piTreg中FoxP3约90%呈阳性。孕不同时期piTreg/CD4~+T比例分别为:0d:5.27%,7d:7.79%,10d:17.70%,12d:22.99%,18d:16.88%。流式细胞分选仪分选后,目的细胞纯度可提高至95%以上。将分选获得Treg、piTreg、na(l|¨)ve T细胞和CD4~+CD25~-T细胞,在含有rhIL-2和anti-CD3/CD28的特殊培养基中,相同条件培养,Treg和piTreg每2～3天增加1倍;而Na(l|¨)ve T细胞和CD4~+CD25~-T细胞每2天增加2倍。CFSE荧光标记na(l|¨)ve T细胞后扩增48h,流式分析可见:荧光强度随着细胞分裂逐代递减。通过ModFit软件分析,效应细胞(na(l|¨)ve T细胞)与刺激细胞扩增培养3天后,na(l|¨)ve T细胞的增殖指数(PI)达20;而Treg、ex-Treg(expanded-Treg)及piTreg以1:1培养时,PI分别为:13.6、15.2、9.6。不同抑制细胞Treg、Treg/10、piTreg、ex-Treg对效应细胞的抑制率分别为0.37±07、0.05±01、0.53±01、0.24。piTreg的抑制效应最强。结论1、妊娠期小鼠体内piTreg会得到扩增,piTreg/CD4~+T的比值随着孕期呈动态变化,孕中后期较高。2、流式分选能将Treg(piTreg)纯度提高到95%以上,适宜于扩增。高浓度的rhIL-2和anti-CD3/CD28能对T细胞进行有效扩增,但piTreg(Treg)的扩增效率较低,2倍/周。T细胞激活后能维持这种活化的状态,持续增殖。3、na(l|¨)ve T细胞扩增3d后,增殖指数(PI)可达20。piTreg与na(l|¨)ve T共培养后,PI仅为8.8,有明显的差异。Treg、ex-Treg和piTreg对效应细胞都有抑制作用,piTreg抑制效率最大。