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研究背景载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)作为调节脂质代谢紊乱和炎症的重要功能蛋白,在抗动脉粥样硬化进程中发挥重要的角色。人类apoE具有显著多态性而成为高胆固醇血症的易感因素,但基因治疗的安全性问题、全长apoE的制备难度及易产生降解片段毒性等缺陷限制其在临床的补偿性治疗应用,因此,研发小分子apoE拟肽是目前进行调脂及防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的有效策略。基于对apoEN端的LDL受体结合域和C端脂质结构域的基础结构与功能的分析,本研究创新设计并优化apoE功能拟肽EpK和hEp,利用基因工程技术得到多肽纯品及慢病毒感染在体表达的手段,分别从细胞水平和apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠模型上探讨拟肽EpK和hEp的功能活性及对小鼠AS的影响及相关分子机制,为筛选临床apoE拟肽类生物药物提供科学的实验依据。方法1.Epk对巨噬细胞的影响:通过PCR,设计合成拟肽Epk,利用基因工程技术构建重组原核表达载体pTWINI-Epk大量表达并纯化,经SDS-PAGE鉴定及质谱分析证实其纯度及序列正确性。圆二色谱法测定多肽二级结构,体内外实验观察EpK对血浆胆固醇水平和血浆脂蛋白分布的影响以及对小鼠腹腔原代巨噬细胞胆固醇外流(放射性同位素标记法)及LPS刺激下巨噬细胞炎性反应(TNFα、JI-6及MCP-ImRNA等)的影响。2.Epk对apoE-/-小鼠AS的影响:构建含apoE的信号肽及EpK的重组慢病毒载体pWPI-EpK-GFP,采用脂质体法瞬时转染293T细胞,蛋白免疫印迹检测其分泌表达,利用apoE基因敲除(apoE-)小鼠在体研究EpK对动脉粥样硬化斑块的影响,即:11月龄雌性apoE-/-小鼠18只随机分两组,分别经眼球后静脉丛注射pWPI慢病毒(Lv-GFP对照组)和含EpK的重组慢病毒(Lv-EpK组)。小鼠普食喂养,每4周间隔采血监测血脂状态,快速蛋白液相色谱(FPLC)进行血浆脂蛋内分布分析,检测血浆对氧磷酯酶(PON1)活性。病毒注射18周后小鼠安乐死,蛋白免疫印迹检测血浆中PON1、apoAI及血清淀粉样蛋白A(SAA)蛋白水平,实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏炎症相关基因(TNFα和IL-6)的mRNA表达水平,并对主动脉根部连续冰冻切片及主动脉胸腹段enface剖面进行油红O染色分析斑块面积。3..hEp对apoE-/-小鼠AS的影响:在Epk基础上进一步优化结构(扩大apoE的LDLR受体结合区及脂质结合区,而改变Lys铰链区),将该拟肽命名为hEp。体外实验观察化学合成的hEp对小鼠腹腔原代巨噬细胞胆固醇外流及LPS刺激下巨噬细胞炎性反应的影响。在体实验采用9月龄的雌性apoE-/-小鼠随机分两组,每组10只,将Lv-GFP/Lv-hEp-GFP慢病毒颗粒进行眼眶后静脉丛输注小鼠体内,使apoE-/-小鼠肝脏高表达并分泌hEp,观察apoE-/-小鼠血脂水平、氧化、炎症状态,对肝脏脂质代谢相关基因的调节及对AS进程的影响。结果1.Epk对巨噬细胞的影响:蛋白免疫印迹及质谱结果证实,成功构建并在原核表达系统表达拟肽EpK,并得到高纯度的EpK多肽。二级结构检测表明EpK可自发形成兼性α螺旋结构,并易于与脂质结合,与血浆孵育及短期注入小鼠体内,观察到EpK未介导血浆胆固醇的清除,主要与血浆HDL结合,并在细胞水平证实了此肽具有促巨噬细胞胆固醇外流和抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的作用。2.Epk对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响:GFP荧光检测/免疫组织化学及蛋白印迹检测均显示,慢病毒注射可使小鼠肝脏高表达EpK并分泌入血,实验中小鼠的体重、脾重、血浆谷丙转氨酶(ALT)活性及IgG含量无明显变化,说明肝脏EpK高表达并未对小鼠免疫及肝功能产生明显不良影响。apoE-/-小鼠肝脏高表达EpK在体实验发现:1)与Lv-GFP组相比,Lv-EpK-GFP组小鼠肝脏炎症因子TNFα/IL-6的mRNA水平明显下调,血浆抗氧化酶PON1的活性/含量,及血浆apoAI的蛋白含量未产生明显影响,而血浆急性应激蛋白因子SAA蛋白水平显著下降;2)肝脏EpK高表达不影响apoE-/-小鼠血浆脂质水平,FPLC显示血浆脂蛋白分布无明显改变;3)肝脏EpK高表达可显著减缓普食喂养的apoE-/-小鼠AS斑块的进程:与Lv-GFP组相比,Lv-EpK-GFP组实验小鼠主动脉根部横截而切片的平均斑块面积明显减少(0.87±0.07mm 2vs 1.03±0.08 mm2;P<0.05);胸腹主动脉en face剖面分析结果显示,Lv-EpK-GFP组实验小鼠主动脉胸腹段斑块面积占管腔的百分比减少了 24.7%(42.0%vs 55.8%,P<0.01)。3.hEp对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响:已荷载脂质的apoE-/-小鼠源腹腔原代巨噬细胞(50μg/mlox-LDL荷载48h)与化学合成的hEp拟舦(20μMg/ml)共孵育24h,可显著降低巨噬细胞脂质沉积,减少体内总胆固醇(TC)及游离胆固醇水平,但不改变胆固醇酯及甘油三酯(TG)水平。hEp还显著降低LPS诱导下巨噬细胞炎症因子IL-6和TNFα的mRNA水平。体内实验结果表明:1)与Lv-GFP组相比,Lv-hEp-GFP组小鼠hEp高表达可使肝脏炎症因子TNFα/IL-6的mRNA水平明显下调,血浆MPO活性及急性蛋白因子SAA水平明显降低,而血浆抗氧化酶PON1的活性显著提高;2)apoE-/-小鼠肝脏hEp高表达可明显降低血浆TC及提高肝脏LDLR基因表达水平,但对血浆TG影响不明显;3)肝脏hEp高表达可显著减缓普食喂养的apoE-/-小鼠AS斑块的进程:与Lv-GFP组相比,Lv-EpK-GFP组实验小鼠主动脉根部横截面切片的平均斑块面积明显减少(0.81±0.07mm2vs0.94±0.06mm2;P<0.05);胸腹主动脉en face 剖面分析结果显示,Lv-EpK-GFP组实验小鼠主动脉胸腹段斑块而积占管腔的百分比减少了24.2%。上述结果提示:肝脏hEp高表达可显著改善apoE-/-小鼠肝脏及循环中的氧还状态,抑制炎症,并降低血浆胆固醇水平,阻抑AS斑块进程。结论EpK作为一种合成的apoE功能拟肽具有促巨噬细胞胆固醇外流和抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的作用,在体肝脏高表达尽管未发挥明显降低血脂的作用,但其显著的抗氧化抗炎作用是可能是其阻抑小鼠AS进程的重要机制;hEp除改善小鼠氧还状态发挥抗氧化、抗炎作用外,其阻抑apoE-/-小鼠AS进程的机制还可能与其发挥降脂作用有直接关系。这两种apoE功能拟肽在不同程度上发挥了全长apoE的生物学功能,有望发展为有效治疗AS及其所致心脑血管疾病的生物技术药物。