基于纳米磁珠与化学发光技术检测广西巴马小型猪PERV的研究

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为解决人源器官严重短缺的问题,人们希望利用动物器官进行异种移植。经多方考虑,人们选择猪作为最合适的供体。而猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)普遍存在于各类猪种中,且能够感染人类细胞,引起了人们的高度重视。广西巴马小型猪具有体型小、遗传稳定、遗传背景清晰等优点,是异种移植的良好供体。为开发巴马小型猪种资源,筛选PERV低拷贝猪,为异种移植提供安全可靠的猪源器官,本研究利用纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)与化学发光(chemiluminescence, CL)技术,建立了一种基于纳米磁珠与化学发光的PERV检测方法,并应用该方法进行了广西巴马小型猪PERV前病毒的检测研究,主要内容包括:1、纳米磁珠的制备及其在血液DNA提取中的应用采用溶剂热法制备出Fe304纳米磁珠,在其表面进行Si02包覆,得到Fe3O4@SiO2复合磁珠,并进行氨基化及羧基化修饰,获得羧基功能化纳米磁珠(CMNPs)。经透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)表征,粒径分析,化学基团的傅立叶变换红外光谱(FT-IR)测定,以及振动样品磁强计(VSM)分析得出:该磁珠形貌良好、粒径均匀、磁性好且为超顺磁性。另外,所制备的Fe3O4@SiO2磁珠能够很好地应用于巴马小型猪的血液基因组DNA的提取。2、基于纳米磁珠与化学发光的PERV检测方法的建立与优化利用CMNPs作为固相载体,分别以pol、env-A、env-B与env-C片段为目标分子,经过生物素标记PCR扩增、固相杂交反应、SA-ALP孵育、加入AMPPD发光的步骤,建立了一种PERV及PERV-A、 PERV-B、PERV-C三种亚型的化学发光检测法。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高。经过条件优化得到最优检测体系为:1mM的SA修饰浓度,10μM的探针修饰浓度,55℃(PERV)、54℃(PERV-A)、50℃(PERV-B)、56℃(PERV-C)的杂交温度,30min的杂交时间。3、广西巴马小型猪PERV相对拷贝数的化学发光检测建立了GAPDH化学发光检测法,结合上述建立的PERV及其亚型的化学发光检测法,进行了PERV及其三种亚型前病毒在20头广西巴马小型猪基因组中的相对拷贝数的检测与分析。结果表明,PERV的相对拷贝数在0.94±0.10至6.79±0.59之间,PERV-A的相对拷贝数在1.01士0.13至7.26±0.64之间,PERV-B的相对拷贝数为0.74±0.08至6.13±0.65之间,PERV-C的相对拷贝数在0.05±0.01至0.44±0.12之间。说明在该20头巴马小型猪的基因组中,PERV前病毒拷贝数各不相同,PERV-C亚型前病毒拷贝数极少。应用上述建立的方法,有助于筛选低拷贝PERV的巴马小型猪,为异种移植提供合适的供体,同时为培育PERV低拷贝猪奠定基础。
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