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第一部分 小鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜神经节细胞和钙离子结合蛋白S100A4的变化目的:观察缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的密度及S100A4蛋白的变化,判断小鼠视网膜I/R建模是否成功。方法:27只成年C57BL/6J小鼠,随机分为I/R后3天、7天组和10天组,右侧眼作为I/R模型组,左侧眼作为对照组,均饲养于相同环境中。I/R模型建立方法简述如下:C57小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉及眼表麻醉后,利用手持眼压计测量小鼠眼压,随后利用复方托吡卡胺进行散瞳。在手术显微镜下,对小鼠眼周进行消毒,用连接无菌盐水瓶的30 G针头在靠近角巩膜缘处插入右侧眼前房。将瓶子提升到150cm的高度,维持60分钟。眼底镜下观察视网膜血管变白。手术后,将妥布霉素眼用软膏涂在小鼠眼部预防感染。只有术后角膜和晶状体未受损的动物被纳入进一步研究。在I/R后3天、7天和10天处死小鼠,立即收集视网膜做全视网膜铺片免疫荧光染色,荧光显微镜拍照后使用Image-J软件对RGCs进行计数。在I/R后7天收集小鼠视网膜蛋白,利用蛋白质免疫印迹法检测（Western blot）小鼠视网膜上S100A4蛋白的表达情况。利用生物医学统计分析软件GraphPad Prism 6.0对数据进行分析。结果:造模前小鼠眼压为（8.3±1.5）mmHg,造模中小鼠眼压为（79.5±1.6）mmHg,差异具有统计学意义（P<0.0001）。对照组RGCs密度为（2403.9±384.5）/mm2,I/R 后 3 天、7 天和 10 天 RGCs 的密度分别为（1132.7±113.8）/mm2、（636.9±135.7）/mm2和（400.1±56.1）/mm2,差异具有统计学意义（F=68.83,P<0.0001）。Western blot检测结果显示,I/R后7天小鼠视网膜中S100A4蛋白相对表达量与对照组相比无明显差异（P>0.05）。结论:小鼠视网膜I/R建模成功,I/R损伤后RGCs的密度明显下降,具有时间依赖性,后续的实验中采用I/R后7天这一时间点进行研究;小鼠视网膜中存在钙离子结合蛋白S100A4,但在I/R损伤后7天,其相对表达量没有明显变化。第二部分 构建带有S100A4基因的重组腺相关病毒载体目的:设计并构建带有S100A4基因的重组腺相关病毒。方法:构建重组腺相关病毒:以EF1α-DIO-oChIEF-P2A-dTomato-WPRE-pA为载体,利用Sali酶和ECoRI酶进行酶切,随后将合成的目的基因EGFP-p2a-S100A4经过PCR扩增后与载体连接。病毒的包装及滴度检测:培养HEK 293细胞,利用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA,然后转染质粒,获得重组腺相关病毒后进行扩增与纯化。最后采用终点稀释法测定病毒的滴度以供使用。结果:经过测序方法鉴定阳性克隆的大肠杆菌阳性菌落,证实EGFP-p2a-S100A4基因片段成功的连入穿梭质粒。后经扩增纯化,测得携带S100A4基因的阳性病毒 rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE 滴度为 3.34x 1012vg/ml,测得仅携带 EGFP 基因的阴性病毒 rAAV-Eflα-EGFP-WPRE-Pa 滴度为 2.80 x 1012vg/ml。结论:成功设计并构建了携带EGFP标签,带有小鼠S100A4基因的重组腺相关病毒,经过纯化后得到较高的滴度,为进一步研究S100A4在视网膜缺血再灌注损伤中的作用和机制提供了实验工具。第三部分过表达S100A4蛋白在视网膜缺血再灌注模型中保护了神经节细胞目的:玻璃体腔注射rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE过表达S100A4基因,利用I/R模型研究S100A4蛋白对视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的作用及其可能的机制。方法:61只成年C57BL/6J小鼠随机分为对照组、I/R组（建立I/R模型后7天取材）、基因过表达组（玻璃体腔注射rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE后4周取材）、空白病毒载体组（玻璃体腔注射rAAV-Eflα-EGFP-WPRE-Pa后4周取材）、基因过表达+I/R组（玻璃体腔注射rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE后4周建立I/R模型,7天后取材）、空白病毒载体+I/R组（玻璃体腔注射rAAV-Eflα-EGFP-WPRE-Pa后4周建立I/R模型,7天后取材）,小鼠均饲养于相同环境中。对照组:30G针头前房快速穿刺。取基因过表达组和空白病毒载体组小鼠,各10只眼,行视网膜冰冻切片观察病毒转染情况。I/R后7天,取除空白病毒载体组外的各组小鼠,各6只眼制作全视网膜铺片,行免疫荧光染色,观察RGCs的数量。取各组小鼠视网膜蛋白,行Western blot检测对照组、基因过表达组和空白病毒载体组视网膜中S100A4的蛋白水平。检测除空白病毒载体组外,其余5组小鼠视网膜上Akt、P-Akt、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。所得数据利用生物医学统计分析软件GraphPad Prism 6.0进行分析。结果:小鼠玻璃体腔注射rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE后4周,共聚焦荧光显微镜下观察到视网膜神经节细胞层、内丛状层和内核层出现了绿色强荧光,外丛状层可见少量弱荧光,说明rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE成功转染至视网膜。Western blot结果显示基因过表达组S100A4蛋白的表达水平与对照组和空白病毒载体组相比显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE成功使S100A4基因过表达。观察视网膜免疫荧光染色铺片发现,I/R组RGCs的数量与对照组和基因过表达组相比,明显下降（P<0.0001）。基因过表达+I/R组的RGCs数量虽然比对照组少,但是却明显多于I/R组（P<0.01）和空白病毒载体+I/R组（P<0.05）,提示过表达的S100A4蛋白对RGCs具有保护作用。Westernblot结果显示,5组小鼠视网膜中Akt的蛋白相对表达水平没有明显变化（P>0.05）,基因过表达+I/R组视网膜中P-Akt的蛋白表达水平与I/R组和空白病毒载体+I/R组相比,均明显升高（P<0.05）。基因过表达+I/R组视网膜中Bax的蛋白表达水平与I/R组和空白病毒载体+I/R组相比,均明显下降（P<0.05）。基因过表达+I/R组视网膜中Bcl-2蛋白表达水平与I/R组和空白病毒载体+I/R组相比,均明显增加（P<0.05）。基因过表达+I/R组Bcl-2/Bax 比率也显著高于I/R组和空白病毒载体+I/R组（P<0.01）。结论:rAAV-Eflα-s100a4-EGFP-WPRE能够有效且快速的转染至小鼠视网膜内层组织,并成功使S100A4基因表达增加。S100A4蛋白过表达后可显著增加I/R损伤后RGCs的数量,这可能是通过增加Akt的磷酸化程度,进而使Bcl-2表达上调,抑制Bax的表达量增加来实现的。