研究背景与目的卵巢癌严重危害妇女健康,其恶性程度居妇科恶性肿瘤首位,因70%的患者在诊断时为晚期,已存在广泛转移,手术不能完全切净,故目前国内外普遍开展以减瘤手术和以铂为基础的联合化疗的综合治疗。80%的卵巢癌患者对顺铂为基础的一线化疗方案是敏感的,遗憾的是约20%的患者可出现原发性铂类耐受,而大部分患者在一线化疗后又出现继发铂类耐受,导致卵巢癌患者预后极差,5年生存率仍徘徊在30%左右,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。晚期卵巢癌治疗的最大障碍是肿瘤细胞的原发或继发耐药性的产生。为此,研究卵巢癌耐药发生机理,特别是铂类耐受的发生机理,寻找克服铂类耐受方法以改善患者预后是目前亟待研究解决的重要课题。近几年来,随着干细胞理论在各种肿瘤研究中的广泛研究和探讨,很多研究人员逐渐认识到在绝大多数癌症中,肿瘤细胞很可能起源于一种肿瘤起始细胞,也就是肿瘤干细胞,它在机体内具有自我更新并形成肿瘤的能力,并且是肿瘤侵袭转移和复发的根源。肿瘤干细胞的存在已在多种肿瘤类型与细胞系中得到证实,并鉴定出相应的分选方法,但人们对这些分选方法却莫衷一是。在实体瘤中,目前只有乳腺癌的肿瘤干细胞免疫分型标志物得到相对广泛的认可,其他癌症肿瘤干细胞标志物都存在很大争议。卵巢癌肿瘤干细胞标志物目前只有少数几篇文献报道,而且都是独立的实验室,后续研究目前还没有发表。因此,卵巢癌干细胞仍需要进行广泛筛选验证和深入研究,对逆转卵巢癌的化疗耐药有重要意义。本项目逆进一步验证各种分离卵巢癌肿瘤起始细胞的各种方法,包括免疫分型法、侧群细胞法、体外无血清悬浮培养法,对各种方法得到的相应肿瘤干细胞的生物学特性进一步验证,从实体瘤肿瘤干细胞的角度来研究耐药机制,为肿瘤的靶向治疗提供了新思路。方法1.肿瘤起始细胞分离方法：(1)基于荧光激活细胞分选法的免疫表型分选法；(2)侧群细胞分离法；(3)悬浮细胞球的培养法2.肿瘤起始细胞干性特征鉴定：(1)RT-PCR鉴定各种干细胞标志物在各种卵巢癌细胞系及分离的肿瘤干细胞中的表达；(2)体外无血清培养单细胞克隆形成条件的摸索；(3)卵巢球体形成及传代培养条件(4)流式细胞仪检测分离得到细胞的细胞周期；(5)体外Borden小室法检测细胞的侵袭转移能力；(6)体内皮下移植瘤形成实验检测分离得到的细胞的成瘤能力及转移潜能3.肿瘤干细胞与化疗耐药相关性研究：(1)体外不同浓度化疗药物诱导后流式细胞仪检测侧群细胞变化；RT-PCR检测耐药相关蛋白表达变化；(2)流式细胞仪AnnexinV-PI检测细胞对化疗药凋亡率；结果1.几种分离体外卵巢癌细胞系肿瘤起始细胞方法结果差异比较大,流式细胞免疫分型法没有检测到CD133及CD117阳性的细胞群,只检测到CD44表达阳性的细胞群。体外无血清悬浮培养法可以得到卵巢球体细胞,但是获得的细胞特性不稳定,传代效果不佳,不适合长时间培养和实验研究。侧群细胞法可以得到较稳定的卵巢癌肿瘤干细胞群,缺点是比例较低,得到细胞较少。后续研究主要采用侧群细胞分离法得到卵巢癌肿瘤干细胞。2.侧群细胞相对于非侧群细胞,高表达干细胞标志物如Oct4,Sox2、Biml等,体外单克隆形成能力、侵袭转移能力明显高于非侧群细胞。细胞周期检测发现,侧群细胞GO期细胞有阻滞现象。动物实验发现500个侧群细胞可以形成皮下移植瘤,是非侧群细胞成瘤能力的100倍。侧群细胞对动物的致死率较高,体内转移能力较强,转移部位主要在肺表面。3.侧群细胞的比例与细胞系耐药性成正比。体外化疗药物诱导后,侧群细胞比例增加,细胞周期也发生GO期阻滞,耐药相关蛋白表达增高。体外实验检测得到侧群细胞对化疗药物敏感性明显低于非侧群细胞,并且有高度耐药的特性。结论1.卵巢癌细胞系有肿瘤干性样细胞存在。CD44可能是卵巢癌肿瘤干细胞标志物之一,而CD133、CD117是否能作为肿瘤干细胞标志物还需要进一步确认。2.侧群细胞分离法是一种研究肿瘤起始细胞比较稳定的方法,缺点是得到的细胞量较少。3.侧群细胞表现出干性特征,并且在动物实验中呈现高度成瘤能力。说明分离得到的是干细胞样肿瘤细胞。4.分离得到的侧群细胞有高度耐药特性,因此,肿瘤起始细胞可能在卵巢癌化疗耐药和复发中起很关键的作用。