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研究背景结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的,经由呼吸道传播的慢性传染病,是全世界单一病原引起死亡人数最多的疾病,致死率已经超过艾滋病。据报道,2015年新发结核病例有1040万,结核致死人数高达180万。因此,结核病对全球人类的健康威胁十分严峻,是亟待解决的全球性公共卫生问题。MTB是一种兼性细胞内寄生菌,入侵机体后主要寄居于宿主巨噬细胞(macrophage,Mφ)。作为结核感染的第一道防线,巨噬细胞表达多种模式识别受体,其中,TLRs是介导宿主对结核分枝杆菌的识别及抗结核免疫反应的关键分子。MTB通过TLR被Mφ识别后,一方面,Mφ可被诱导产生一系列促炎因子,构建炎性微环境,发挥抗菌效应;另一方面,促进杀菌的炎症反应同时也是导致病理损伤的机制。宿主无论是处于潜伏期还是活动期,结核病所表现出的核心病理特征均体现为过度失调的炎症反应。因此,对于MTB感染诱导的Mφ炎症反应的调控是控制结核病发展的重要环节。β-arrestin 2是TLR/IL-1R信号下游至关重要的免疫激活负调节器,能调控MAPK、NF-κB等信号通路的效应,而MAPK通路是参与抗MTB天然免疫的TLR下游关键信号通路。ERK1/2作为MAPK家族的成员之一,介导多种影响MTB感染结局的效应,从而受到广泛关注。因此,本研究主要着眼于β-arrestin 2对ERK1/2通路的调控。泛素化修饰对β-arrestin 2调控信号通路的效应至关重要。已有多项研究发现,β-arrestin 2泛素化是其发挥ERK1/2支架蛋白活性,介导受体内吞所必须的。然而,MTB感染Mφ中β-arrestin 2泛素化修饰对TLR下游ERK1/2通路的调控尚未见报道。本课题首次探讨了这一问题,发现沉默E3泛素连接酶Mdm2的表达,可显著抑制卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)感染后β-arrestin 2依赖的、ERK1/2调控的促炎细胞因子表达。可见,β-arrestin2泛素化与ERK1/2信号通路在结核感染中的效应息息相关。本课题探究了 β-arrestin 2通过调控ERK1/2通路调节MTB感染Mφ的炎症免疫应答的效应与机制,并初步探讨了 β-arrestin 2泛素化在此过程中的调节作用。通过探究上述机制,有助于开发通过β-arrestin 2精准调控MAPK通路的抗结核药物,对结核病防治具有重要意义。研究内容1.检测MTB对Mφ中β-arrestin 2的表达调控效应,以及β-arrestin 2对Mφ抑菌活性的调节作用;2.检测β-arrestin 2对MTB感染的Mφ中炎症反应的调节作用;3.探讨β-arrestin 2调节Mφ炎症反应及抑菌效应的分子机制。研究方法1.检测MTB对Mφ中β-arrestin 2的表达调控效应,以及β-arrestin 2对Mφ抑菌活性的调节作用1)采用实时荧光定量PCR与Western blot,检测MTB感染Mφ中β-arrestin 2的mRNA与蛋白表达水平;2)通过平板菌落计数实验,检测沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的抑菌活性。2.检测β-arrestin 2对MTB感染的Mφ中炎症反应的调节作用采用实时荧光定量PCR与Luminex技术检测沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的促炎因子与抗炎因子表达。3.探讨β-arrestin 2调节Mφ炎症反应及抑菌效应的分子机制1)U0126抑制ERK1/2通路后,实时荧光定量PCR检测β-arrestin 2表达沉默对MTB感染Mφ促炎因子表达的调节效应;2)Western blot检测沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的ERK1/2通路活化;3)免疫荧光-激光扫描共聚焦显微镜观察MTB感染Mφ中,β-arrestin 2与p-ERK1/2共定位与转位;4)免疫共沉淀检测MTB感染Mφ中β-arrestin 2与ERK1/2通路蛋白的结合,以及β-arrestin 2的泛素化修饰;5)实时荧光定量PCR检测Mdm2表达沉默对MTB感染Mφ的细胞因子表达调节。结果1.β-arrestin 2 mRNA表达水平在感染后Mφ中先下调、后上升;相反,β-arrestin 2蛋白表达水平逐渐提高,至感染后72 h开始下调;β-arrestin 2表达被沉默后,促进了 Mφ的抑菌活性。2.沉默β-arrestin 2表达后,BCG感染THP-1-Mφ的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著上升,而抗炎因子IL-10、TGF-β在THP-1-Mφ与原代Mφ的变化则存在不同。β-arrestin 2对促炎因子表达的调节效应与其对Mφ抑菌活性的调节效应一致,提示其通过调节促炎因子表达而发挥调节Mφ抑菌活性的效应。3.抑制ERK1/2通路后,可逆转β-arrestin2表达沉默对促炎因子表达的促进效应。β-arrestin 2表达沉默不改变BCG感染THP-1-Mφ中ERK1/2通路的活化水平,但内源性β-arrestin2可抑制p-ERK1/2的核转位。同时,BCG的感染能促进β-arrestin 2与p-ERK1/2、p-TPL2的结合,使β-arrestin 2泛素化水平增加。与此相一致,沉默E3泛素连接酶Mdm2表达与沉默β-arrestin 2对促炎因子表达的调节效应相似。结论β-arrestin 2在MTB感染Mφ中表达上调,并参与调节MTB诱导的ERK1/2核转位,由此调控被感染Mφ炎症反应及抑菌活性;该过程中,β-arrestin 2泛素化水平上调,抑制泛素化则增强ERK1/2通路的转录调控效应。