论文部分内容阅读
原花色素是葡萄主要的多酚物质之一,同时也是葡萄酒中非常重要的保健成分,对葡萄果实和葡萄酒的色泽、风味、收敛性以及苦味起着非常显著的作用。转录因子通过调节原花色素合成中相关基因的表达,从而调控其原花色素的生物合成。本文采用酵母双杂交（Yeast two-hybrid system）检测MYBPA1和MYBPA2转录因子分别与原花色素生物合成酶相关基因（ANS、DFR、ANR、LAR1、LAR2）的互作机制;利用病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing）技术,通过构建TRV2-PDS病毒载体建立及优化葡萄叶片TRV-VIGS体系,分别沉默转录因子MYBPA1、MYBPA2后测定原花色素含量及分析原花色素生物合成中相关基因的表达量,以期阐明转录因子MYBPA1、MYBPA2在原花色素生物合成中调控机理,为进一步阐明原花色素生物合成调控机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.蛋白互作分析根据VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvANR、VvDFR、VvANS、VvLAR1、VvLAR2基因序列和pGBKT7、pGADT7多克隆酶切位点,分别构建了表达载体pGBKT7-MYBPA1、pGBKT7-MYBPA2、pGBKT7-ANR、pGBKT7-LAR1、pGBKT7-LAR2、pGBKT7-DFR、pGBKT7-ANS、pGADT7-MYBPA1、pGADT7-MYBPA2。通过鉴定其蛋白的转录激活功能,发现只有pGBKT7-MYBPA1、pGBKT7-MYBPA2编码的蛋白有转录激活功能,而pGBKT7-ANR、pGBKT7-LAR1、pGBKT7-LAR2、pGBKT7-DFR、pGBKT7-ANS蛋白不具有自激活活性且无毒性。酵母双杂交结果表明,MYBPA1与DFR会发生互作反应,且互作能力强,可以结合形成稳定的复合物。而MYBPA2与DFR的互作能力较弱。MYBPA1和MYBPA2分别与ANR、LAR1、LAR2、ANS都会发生互作,但互作能力较弱。2.葡萄叶片VIGS体系的建立利用RT-PCR技术克隆出葡萄PDS基因片段,并反向插入pTRV2病毒载体上。通过研究早黑宝葡萄不同叶龄的叶片（幼叶和成熟叶片）在不同浓度的侵染液(OD600=0.5、1.0、1.5、3.0)下采用不同侵染方式（真空渗透法和农杆菌注射法）进行侵染,然后置于不同温度（19℃、22℃、25℃、27℃）下培养的基因沉默效率。发现培养15 d后,采用真空渗透侵染方式葡萄幼叶最早出现全叶漂白现象。获得了侵染液浓度为1.0、真空渗透、培养温度25℃的葡萄幼叶最优化VIGS体系。3.VvMYBPA1、VvMYBPA2基因沉默以早黑宝葡萄幼叶为试材,分别将VvMYBPA1、VvMYBPA2非保守序列反向插入pTRV2载体上,在侵染液浓度为1.0时,采用真空渗透侵染方式侵染葡萄叶片。培养15 d后发现,沉默MYBPA1、MYBPA2后的原花色素含量与对照组相比明显下降,且都成极显著性差异（p<0.01）。半定量分析结果表明,沉默后MYBPA1、MYBPA2表达量很低;qRT-PCR分析结果显示:MYBPA1沉默后,VvMYBPA1、VvANR、VvDFR、VvUFGT、VvLAR2基因表达量明显降低,与对照相比表现为极显著差异（p<0.01）;VvMYBPA2、VvANS基因表达量下降,与对照相比表现为显著差异（p<0.05）;VvLAR1不显著。MYBPA2沉默后,VvMYBPA2、VvANR、VvDFR、VvUFGT基因表达量与对照相比明显降低,且呈极显著性差异（p<0.01）,同时VvLAR1、VvMYBPA1、VvLAR2、VvANS基因的表达量也明显降低,与对照相比表现为显著差异（p<0.05）。