芽孢杆菌B1胞外活性物质的分离鉴定及溶藻机制的研究

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球形棕囊藻是我国珠江口海域典型的优势藻种之一,近年来爆发日益频繁,对我国经济和海洋生态环境造成了严重的威胁。采用物理法和化学法治理赤潮,由于受到成本和二次污染等因素制约,经济、高效、环保的生物法治理赤潮尤其以菌控藻已成为赤潮治理领域的一个新的研究热点。基于课题组已从珠海球形棕囊藻赤潮爆发的海域中分离筛选得到一株溶藻芽孢杆菌B1,本论文对B1菌的溶藻方式及溶藻效果,溶藻活性物质的分离鉴定及溶藻机制进行了研究。主要结果如下:(1)B1菌是通过分泌胞外活性物质的间接方式对球形棕囊藻、中肋骨条藻、东海原甲藻及赤潮异弯藻起溶藻作用,溶藻效果与B1无菌滤液的投加量成正相关。当B1无菌滤液的投加量为4%(V无菌滤液/V藻液=1/25)时,对四种赤潮藻的溶藻效果是:球形棕囊藻>中肋骨条藻>东海原甲藻>赤潮异弯藻,除藻率分别为:92.3%、91.8%、89.4%和84.4%。(2)采用ODS-A柱层析法和HPLC对B1菌分泌的胞外活性物质进行分离纯化,最终得到四种对球形棕囊藻除藻率分别为46.9%、50.3%、55.0%和55.7%的活性物质。对这四种活性物质进行Q-TOF-MS测定,采用PeakViewTM软件分析Q-TOF-MS测得的数据,推断出溶藻活性物质分别为L-组氨酸、o-酪氨酸、N-乙酰组胺和咪唑丙烯酸。(3)B1菌分泌的胞外活性物质经硅胶柱层析、Sephadex G-15柱层析和HPLC分离纯化,得到了两种除藻率为59.5%和54.6%的溶藻活性物质。采用Q-TOF-MS和PeakViewTM软件对其进行结构测定和分析,发现这两种溶藻活性物质为脯氨酰蛋氨酸和次黄嘌呤。(4)对已鉴定出的L-组氨酸等六种溶藻活性物质进行了溶藻实验,结果显示L-组氨酸仅对球形棕囊藻有溶藻效果,而o-酪氨酸、N-乙酰组胺、咪唑丙烯酸、脯氨酰蛋氨酸和次黄嘌呤对球形棕囊藻、东海原甲藻、赤潮异弯藻和中肋骨条藻均有溶藻效果,说明B1菌分泌的胞外活性物质具有较好的广谱杀藻性。(5)溶藻机理研究表明,溶藻活性物质通过抑制藻体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,致使藻体内有害活性氧自由基(ROS)不断积累,丙二醛(MDA)含量不断上升,细胞膜脂质过氧化程度加剧,最终导致细胞膜系统和功能的破坏,细胞因溶解而死亡。即芽孢杆菌B1分泌的胞外活性物质是通过扰乱细胞抗氧化系统来抑制藻类的生长繁殖。
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