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小儿急性淋巴细胞白血病（ALL）/淋巴瘤患儿对糖皮质激素（GC）的敏感性与其治疗效果和预后密切相关，GC原发或继发耐药者预后不良。探讨GC诱导敏感细胞凋亡的分子机制，可为进一步探索ALL/淋巴瘤细胞GC耐药的机理，寻找克服GC耐药的方法，进一步提高小儿ALL/淋巴瘤的治愈率打下基础。Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是新近发现的Bcl-2家族中促凋亡亚家族成员，在多种药物抗肿瘤活性中起重要作用。为探讨Bim在DEX诱导的敏感细胞凋亡中的作用及其调控机理，我们首先研究了Bim在DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡中的作用；然后以人T-ALL细胞株CEM-C7细胞为研究对象，探索前凋亡因子Bim在DEX诱导CEM-C7细胞凋亡中的作用及其所涉及的细胞内信号转导机制；最后，我们从HL-60细胞中克隆了人Bim基因三个异构体中促凋亡活性最强的BimS基因，构建了人BimS基因重组腺病毒，并用其感染对DEX耐药的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞，观察BimS对Raji细胞的促凋亡作用，为肿瘤生物治疗特别是为GC耐药的ALL/淋巴瘤的基因治疗打下实验研究基础。1．DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡是DEX诱导细胞凋亡的经典模型。我们以1μmol/L DEX诱导体外培养的BALB/c小鼠胸腺细胞，采用透射电镜、AnnexinV/PI双染流式细胞术、DNA凝胶电泳检测细胞凋亡；RT-PCR半定量法分析1μmol/L DEX作用不同时间及不同浓度DEX作用小鼠胸腺细胞1h BimmRNA表达。结果显示：DEX成功诱导了小鼠胸腺细胞凋亡，在DEX作用后早期（1/2h）细胞凋亡与对照相比尚无显著差异时Bim mRNA表达即升高，以后各时间点Bim表达水平均较对照细胞（自然凋亡）高且表达高峰前移（BimL、BimEL 1h达高峰），以BimL mRNA增高最明显；以0、10+2、10-1、100、10μmol/L终浓度的DEX作用小鼠胸腺细胞1h，Bim mRNA表达随DEX终浓度增加而升高，也以BimL mRNA表达增高最明显。上述结果表明，Bim参与了DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡过程，是重要的细胞凋亡促进因子，Bim三个异构体中以BimL作用为主；DEX诱导的小鼠胸腺细胞Bim mRNA表达升高发生在细胞凋亡早期，其表达水平随作用时间变化，并在一定DEX浓度范围内呈剂量依赖性。2．为探讨前凋亡因子Bim在DEX诱导的ALL细胞凋亡中的作用，我们以DEX作用于GC敏感的人T-ALL细胞株CEM-C7细胞，应用透射电镜、PI染色流式细胞术、荧光定量PCR技术观察细胞凋亡和Bim mRNA表达，Westem blot检测DEX作用24h后Bim蛋白表达水平。结果显示：在lμmol/L DEX作用下，敏感的CEM-C7细胞发生凋亡；在细胞凋亡早期（4h）即检测到Bim mRNA表达升高，以后各时间点Bim mRNA表达均较对照（不加DEX）增高（p＜0．05）；DEX作用24h后Bim蛋白表达显著上调，而DEX耐药的T-ALLCEM-C1细胞在DEX作用24h后则无Bim蛋白表达增加；表明Bim参与了DEX诱导T-ALLCEM-C7细胞凋亡过程，在细胞凋亡早期起重要作用，DEX作用后Bim蛋白表达不能上调是ALL细胞对GC耐药的重要机制之一。为确定GC-GR信号转导路径与DEX诱导的Bim表达的关系，我们用GR阻断剂RU486和DEX共同作用于CEM-C7细胞，与单用DEX的对照相比，各时间点Bim rnRNA表达水平均降低，Bim蛋白的表达也明显减少，同时细胞凋亡受到抑制，表明GC-GR结合环节是DEX诱导敏感的CEM-C7细胞Bim表达和细胞凋亡过程的关键步骤；P38 MAPK抑制剂SB203580预孵育CEM-C7细胞30min，再以1μmol/L DEX培养18h，CEM-C7细胞Bim mRNA表达较单用DEX明显降低，表明DEX诱导对其敏感的CEM-C7细胞Bim mRNA表达过程有P38-MAPK信号转导路径的参与。3．为构建BimS重组腺病毒载体，我们根据GeneBank数据库提供的Bim基因核苷酸序列，采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因BimS；克隆至T载体测序正确。亚克隆BimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上，形成含目的基因的pAdtrack-CMV-BimS穿梭载体。pAdtrack-CMV-BimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-CMV-BimS，线性化后脂质体法转染人胚肾（HEK）293细胞进行病毒的包装、扩增。结果显示，重组腺病毒滴度达到1．6×108IU/ml，病毒上清液经PCR扩增有BimS特异条带，Westem blot表明pAdEasy-CMV-BimS转染的293细胞有BimS蛋白的高表达，表明前凋亡因子BimS的重组腺病毒（Ad-BimS，下同）构建成功。4．人Burkitt淋巴瘤Raji细胞对DEX耐药，我们以重组腺病毒Ad-BimS感染人Raji细胞，采用RT-PCR、Western blot检测BimS mRNA及蛋白在该肿瘤细胞的表达，观察细胞生长曲线，流式细胞术检测病毒感染对Raji细胞生长和凋亡的影响。结果显示：重组腺病毒Ad-BimS感染Raji细胞2～5d后，外源基因BimS在mRNA和蛋白表达水平上均较对照明显升高；感染第4d、5d，受感染Raji细胞的计数显著低于对照组（感染空病毒，p＜0．05）；感染第3～5d，受感染Raji细胞凋亡百分率较对照（感染空病毒）显著增加（p＜0．05）；表明Ad-BimS感染抑制了Raji细胞生长，促进了其凋亡。综上，前凋亡因子Bim参与了DEX诱导的小鼠胸腺细胞和人T-ALL细胞系CEM-C7细胞的凋亡过程，DEX诱导后Bim表达不能上调是ALL细胞GC耐药的重要机制之一；DEX诱导Bim表达是通过GC-GR细胞内信号转导途径介导的，P38-MAPK信号途径也参与DEX诱导的敏感细胞Bim表达的调控；重组腺病毒Ad-BimS感染可抑制GC耐药的Burkitt淋巴瘤Raji细胞生长，并诱导其凋亡，为GC耐药的ALL/淋巴瘤治疗提供了基因治疗的新方法。