生姜内参基因的筛选及生姜ZoARF2基因载体构建

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生姜(Zingiber officinale Roscoe)作为药食同源的香辛类作物,具有较高的食用价值与经济价值。研究生姜中一些重要的功能基因对生姜的生长发育有着重大帮助。实时荧光定量PCR技术是目前分析基因表达的重要方法,而稳定的内参基因是准确定量基因表达水平的先决条件。由于生姜数据库的不完善,生姜中尚未筛选出稳定的内参基因,因此对生姜的内参基因的筛选必不可少。本试验以生姜为研究对象,应用qRT-PCR技术,研究生姜在采后失水处理后和生姜不同部位中在11个候选内参基因的表达情况。再利用geNorm、NormFinder、Bestkeeper三个软件分析后确定候选内参基因的表达稳定性,以及引入的内参基因数量,从而更好的为生姜目的基因表达分析进行校正。经试验研究后,发现ACT2和TUB2两个基因可作为生姜不同部位定量分析时内参基因,需引入的3个内参基因来进行校正。在生姜失水处理后,TUB2在一定程度上适合作为定量分析的内参基因,推荐使用2个内参基因组合作为在基因表达定量分析校正。表明在生姜所有的样品中(生姜的不同部位和生姜失水处理),最适合作为内参定量分析的为TUB2基因。生姜的食用部分为地下肉质根状茎,根状茎是重要的产品器官,对于产量的形成具有重要的意义,但是关于生姜根茎膨大的分子机制尚不清楚。在已报道的物种中,发现ARF2基因是一个多效性的转录因子,对植物的在不同生长发育阶段及发挥着重要的作用。从生姜前期转录组测序中发现ARF2基因在根茎膨大过程中表达量较高,猜测ZoARF2基因可能会对生姜地下根状茎发育起着调控作用,因此选择ARF2基因作为本试验的研究对象。本试验通过对生姜ZoARF2蛋白的理化性质分析,发现该蛋白为可溶性蛋白,但不稳定。通过氨基酸序列推测ZoARF2蛋白可能具有激活功能。依据ARF蛋白的氨基酸序列的同源关系,发现它与葡萄、水稻、拟南芥等ARF2氨基酸序列在保守区域内有较高的同源性。通过qRT-PCR分析发现,生姜ZoARF2基因在根、根状茎、茎、叶中均有表达,其中在叶片的表达量最高,根状茎的表达量仅次于叶的表达量。不同组织间的表达具有一定的差异性,表明该基因可能参与了生姜在不同组织间发挥着不同的调控作用。另外本试验成功的构建出ZoARF2的表达载体,为进一步深入研究ZoARF2的功能提供了基础。综上,本文研究的结果为生姜内参基因选择和基因表达分析提供了重要的理论参考及技术支持,为后续生姜基因功能研究和根茎膨大机理研究奠定了基础等。
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