背景:内质网（endoplasmic reticulum,ER）是真核细胞中蛋白质、脂类和糖类合成的重要细胞器。来自肿瘤细胞内外的多种刺激,如氧化应激、营养缺乏、紫外线照射等致使大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白积累在内质网腔内,造成内质网应激（ER stress）。一方面,内质网应激引起的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）可以通过限制新蛋白质合成,放大ER的蛋白折叠能力,并加速未折叠或错误折叠蛋白质的降解,促进肿瘤细胞的生存生长和保护性自噬;而另一方面,未折叠蛋白反应的持续活化将导致肿瘤细胞凋亡或自噬性死亡。因此,内质网应激在肿瘤发生发展中具有两面性,并成为研究热点和日趋重要的肿瘤治疗靶点。脑胶质瘤是临床最常见的颅内原发恶性肿瘤,具有高度异质性、高度浸润性、极易复发性等特点,临床欠缺有效治疗手段。研究发现,内质网应激通路与胶质瘤细胞内蛋白稳态密切相关。目前,已有多种靶向UPR治疗脑胶质瘤的药物和手段用于临床研究。FKBP（FK506 binding protein）家族是一类可以与免疫抑制剂特异性结合的蛋白,在不同组织中广泛存在。FKBPs具有肽脯酰胺异构酶（PPIase）活性,通常含有三个结构域:TPR（tetratricopeptide repeat domain）,FKBP＿C（FK506 like binding protein C-terminal domain）和TMD（transmembrane domain）。研究表明FKBP家族蛋白参与肿瘤细胞生长、存活和凋亡中的多种信号通路,特别是与肿瘤发展和化疗抵抗密切相关。以胶质瘤为例,FKBP12作为与m TOR互作蛋白,与Rapa Link-1结合抑制胶质瘤;FKBP52与TDO（tryptophan-2,3-dioxygenase）在脑胶质瘤和正常脑组织中呈负相关,且地塞米松对TDO表达和活性的抑制依赖于FKBP52;抗凋亡蛋白FKBP14在胶质瘤对厄洛替尼的耐药抵抗中起决定作用;FKBP5通过对胶质瘤细胞中NF-κB通路的活化促进肿瘤生长和耐药抵抗。FKBP9定位于内质网。研究显示FKBP9在胶质瘤、胰腺癌、肾癌、黑色素瘤等多种肿瘤组织中高表达,提示其可能在相关肿瘤的发生发展中发挥重要作用。此外,对大量胶质瘤临床组织样本测序发现,FKBP9与TP53、PTEN、EGFR等肿瘤明星分子在胶质瘤中大量扩增的同时存在突变,而这种突变可能与胶质瘤不同亚型的鉴定有关。然而,目前对于FKBP9在包括胶质瘤在内的肿瘤中的研究报道较少,其在脑胶质瘤中的作用和机制尚不明确。目的:本研究旨在阐述FKBP9在胶质瘤中的功能和作用机制。通过构建稳定敲低和稳定过表达FKBP9的胶质瘤细胞,探究内质网定位蛋白FKBP9与内质网应激之间的关系,并研究FKBP9自身的调控机制。本研究将为胶质瘤的诊疗提供新思路。方法:1.临床数据分析2.免疫组织化学检测临床组织样本中蛋白表达3.FKBP9野生型、各结构域缺失体和突变体的质粒构建4.慢病毒感染稳定表达和稳定敲低FKBP9,腺病毒瞬时表达FKBP95.CCK8细胞活力检测、平板克隆形成、Transwell侵袭、3D培养细胞成球6.鸡胚绒毛尿囊膜侵袭模型7.裸鼠皮下成瘤模型8.免疫共沉淀检测蛋白相互作用9.免疫荧光观察蛋白细胞内共定位结果:1.FKBP9在胶质瘤中的临床意义。1)FKBP9在胶质瘤中高表达,与患者预后不良相关。2)FKBP9表达与肿瘤恶性程度有关,临床分期分级越高,FKBP9表达越高。2.FKBP9在胶质瘤细胞中的表达。1)FKBP9在胶质瘤细胞中高表达且定位于胞内内质网。2)FKBP9在胶质瘤3D成球细胞中蛋白表达水平明显高于2D细胞。3.敲低FKBP9在体内外抑制胶质瘤。1)敲低FKBP9抑制胶质瘤细胞增殖。2)敲低FKBP9抑制胶质瘤细胞侵袭。3)敲低FKBP9抑制胶质瘤细胞成球,即锚定非依赖性生长。4)敲低FKBP9使胶质瘤细胞对TMZ更敏感。5)敲低FKBP9抑制胶质瘤细胞体内侵袭。6)敲低FKBP9抑制胶质瘤细胞体内成瘤。4.FKBP9-M541I突变体在促癌作用明显弱于野生型。1)过表达FKBP9促进胶质瘤细胞增殖,过表达FKBP9-M541I无此效应。2)过表达FKBP9促进胶质瘤细胞成球,过表达FKBP9-M541I无此效应。3)过表达FKBP9促进胶质瘤细胞体内成瘤,过表达FKBP9-M541I无此效应。5.FKBP9活化p38信号通路。通过Western Blot检测MAPK、AKT-mTOR、Wnt等通路关键蛋白,发现过表达FKBP9,p38磷酸化水平上调,敲低FKBP9,p38磷酸化减少,腺病毒过表达FKBP9可回复。6.FKBP9与内质网应激之间的联系。1)敲低FKBP9诱导内质网应激。敲低FKBP9增强ATF6的转录活性,内质网应激下游基因DDIT3、DNAJB9和SEL1L转录水平升高,IRE1α-XBP1通路活化。2)过表达抵抗内质网应激引起的细胞死亡。Tg（Thapsigargin）处理诱导内质网应激,过表达FKBP9-WT细胞中Bcl-2家族抗凋亡蛋白显著增加,促凋亡蛋白减少。7.FKBP9与Bi P存在相互作用和共定位。8.内质网应激促使FKBP9发生泛素化降解。1)内质网应激诱导剂BFA（Brefeldin A）、Tg（Thapsigargin）和Tm（Tunicamycin）处理细胞,均可减弱FKBP9的蛋白表达,而FKBP9的转录水平不受影响。2)内质网应激抑制剂和UPR通路抑制剂预处理,逆转上述药物引起的FKBP9的下调。3)Tg诱导的FKBP9蛋白水平的减少可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断,内质网应激时,FKBP9发生泛素化降解,其中第265位赖氨酸是泛素化关键位点。综上所述,本研究中发现FKBP9促进胶质瘤细胞增殖、侵袭、成球,以及体内成瘤能力。敲低FKBP9可诱发内质网应激,过表达FKBP9抵抗内质网应激所致的细胞死亡。此外,在药物诱导的内质网应激条件下FKBP9发生泛素化降解。结论:1.FKBP9促进胶质瘤增殖、侵袭、锚定非依赖性生长和体内成瘤,可能通过活化p38通路2.FKBP9通过与BiP相互作用,参与内质网应激通路调控3.FKBP9自身可在内质网应激中被泛素化降解