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目的:研究靶向Livin的microRNA干扰对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞SKOV3的体外作用。构建两个microRNA干扰序列连接到质粒载体并转染人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞,检测转染前后Livin mRNA的表达变化以及细胞增殖、凋亡和周期的改变。探讨针对凋亡抑制基因Livin的靶向治疗对卵巢癌逆转的可行性,为卵巢癌靶向性治疗提供理论基础和实验依据。方法:1.体外复苏、培养并连续传代人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞,并于倒置显微镜下观察细胞的形态。2.设计合成特异性靶向Livin基因的microRNA序列,并连接到质粒载体,该载体表达绿色荧光。用脂质体法转染对数生长期的SKOV3细胞。分别于转染后24h、48h在荧光显微镜下观察细胞的形态和荧光细胞数,以判断转染的效率。3.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Livin mRNA表达水平的变化。4.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测microRNA干扰对SKOV3细胞体外生长的增殖抑制作用。5.采用流式细胞术(FCM)检测microRNA干扰对SKOV3细胞周期分布及凋亡的影响。结果:1.光镜与荧光显微镜显示:靶向Livin的microRNA转染后24h,对照组培养基清亮,细胞生长密集,光泽度好;转染组细胞密度较对照组低,光泽度下降,荧光显微镜下可见部分细胞呈现绿色荧光。转染后48h,对照组细胞已有重叠生长,转染组细胞贴壁率下降,贴壁细胞在荧光显微镜下呈现绿色荧光,荧光细胞数占细胞总数70%-80%,证明转染成功。2.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果显示:靶向Livin的microRNA转染后48h,对照组、阴性转染组、实验转染组的Livin mRNA两个亚基条带与内参条带灰度值比。Livinα在对照组和阴性转染组灰度比值分别为0.58±0.21%、0.53±0.06%,在实验转染组为0.36±0.06%,实验转染组灰度比值明显小于对照组和阴性转染组,组间比较差异有显著性(P <0.05)。Livinβ在对照组和阴性转染组灰度比值分别为0.75±0.10%、0.73±0.15%,在实验转染组为0.48±0.20%,实验转染组灰度比值明显小于对照组和阴性转染组,组间比较差异有显著性(P<0.05)。以上结果显示Livin mRNA的α与β两个亚基在转染后SKOV3细胞中的表达水平明显减弱。表明靶向Livin基因的microRNA干扰对于人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞具有可行性。3.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测结果显示:以阴性转染组、实验转染组与对照组的抑制率相比较,靶向Livin的microRNA转染后24h,阴性转染组细胞的生长抑制率为2.44±0.78%,而实验转染组为30.37±2.17%,组间比较差异有显著性(P<0.05);转染后48h,阴性转染组抑制率为2.54±0.30%,实验转染组为46.49±3.36%,组间比较差异有显著性(P<0.05);转染后72h,阴性转染组细胞生长抑制率为3.33±0.20%,实验转染组为55.26±2.69%,组间比较差异有显著性(P<0.05)。转染后24h到72h细胞抑制率呈增高趋势,说明microRNA干扰对SKOV3细胞生长抑制率的影响呈一定的时间依赖性。4.流式细胞术(FCM)结果显示:靶向Livin的microRNA转染后48h,对照组无明显凋亡峰出现,各转染组在细胞周期G1期前出现了亚二倍体凋亡峰且S期细胞比例下降,G0/G1期细胞比例上升,凋亡率增高。对照组及阴性转染组细胞凋亡指数分别为1.26±0.19%、5.57±0.21%,实验转染组为17.44±1.41%,实验转染组细胞凋亡指数明显高于对照组及阴性转染组,组间比较差异有显著性(P<0.05);对照组及阴性转染组细胞增殖指数分别为76.97±2.80%、69.20±2.26%,实验转染组为53.47±2.51%,实验转染组细胞增殖指数明显低于对照组及阴性转染组,组间比较差异有显著性(P <0.05)。表明microRNA干扰对SKOV3细胞增殖具有明显抑制作用。结论:1.设计并合成了靶向Livin的microRNA序列,经质粒连接、脂质体介导可成功转染对数生长期的人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞。2.靶向Livin的microRNA干扰能下调人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞中Livin mRNA的表达。从而为microRNA在RNAi及基因靶向治疗的可行性方面提供了实验依据。3.靶向Livin的microRNA干扰对人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞的体外增殖具有明显抑制作用,且具有一定的时间依赖性。4.靶向Livin的microRNA干扰能将人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞周期阻滞于G0/G1期,影响肿瘤细胞DNA的合成;并造成细胞周期G1期前明显的亚二倍体凋亡峰的出现,说明其在抑制卵巢癌细胞增殖的同时尚能诱导细胞凋亡。本实验仅是初步的基础研究,关于其确切机制,有待进一步深入探索。