猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）是一种单股正链RNA病毒，为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原，主要引起母猪的繁殖障碍及仔猪严重的呼吸系统疾病，给全球各国的养猪业带来巨大的经济损失。研究发现，PRRSV可以通过多种策略逃避或抑制宿主机体的免疫应答，特别是干扰素（Interferon,IFN）介导的天然性免疫应答，这使得对于该病的防制困难重重。已知PRRSV能够通过阻断IFN激活的下游信号通路来抑制宿主的天然性免疫应答，但其作用机制目前仍不十分清楚，因此，为了进一步了解PRRSV对I型IFN信号通路的影响及其抑制I型IFN下游信号通路的机制，为研制出更有效而安全的预防PRRS的疫苗提供科学依据，笔者对本实验室纯化得到的干扰素诱导型PRRSV毒株进行了分析，并比较了不同毒株对干扰素信号通路的影响,探究了其抑制I型IFN下游信号通路的机制，取得以下结果：1.对疑似干扰素诱导型PRRSV毒株的鉴定。通过用特异性引物进行RT-PCR检测、用PRRSV单抗进行免疫荧光检测及用PRRSV阳性猪血清进行病毒蛋白检测等，确定该纯化毒株确为PRRSV，并命名为A2MC2。对A2MC2全基因组进行测序，序列提交GenBank（GenBank ID: JQ087873）。序列分析结果显示，A2MC2与VR-2332和MLV核苷酸序列相似性高达99.8%。通过检测病毒培养液中干扰素的活性和细胞内干扰素诱导基因(ISG15,ISG56和STAT2)的表达等，确定A2MC2能够在MARC-145和PAM细胞内诱导产生干扰素，并且引起IFN诱导基因表达地上调。2.比较A2MC2与PRRSV其他毒株的毒力及对干扰素信号通路的影响。通过观察病毒致猪肺泡巨噬细胞（PAMs）的病变和病毒感染对细胞活性的影响，发现在细胞培养上，A2MC2对细胞的毒力与MLV相似，毒力较弱。ELISA检测发现，A2MC2与其他毒株不同，它可直接诱导细胞产生IFN-α2,而且对I型IFN下游信号通路不产生抑制作用，不影响IFN-α诱导的ISG15、ISG56和STAT2表达地上调。3.比较PRRSV不同毒株对I型IFN下游信号通路的影响。用不同PRRSV毒株（VR-2385，Ingelvac PRRS MLV，VR-2332，NVSL97-7895，MN184和Lelystad）分别感染MARC-145细胞和PAM细胞，检测细胞内ISG15和ISG56的转录水平及ISG56和STAT2的蛋白水平的改变。结果显示，在MARC-145细胞上，与对照细胞相比，除MN184外，其余被检测毒株均能抑制IFN-α诱导的ISGs和STAT2的表达水平上调。而在PAM细胞上，除了NVSL和MLV，其它被检测毒株都能抑制IFN-α诱导的STAT2的表达水平上调。这一结果表明PRRSV不同毒株在MARC-145细胞和PAM细胞上对IFN信号通路的抑制能力不同。4.筛选对I型IFN下游信号通路有抑制作用的PRRSV病毒蛋白。以VR-2385为代表毒株，通过检测荧光素酶报告基因的表达，筛选PRRSV的11个非结构蛋白和8个结构蛋白中对IFN激活应答元件（ISRE）有抑制作用的病毒蛋白。结果发现Nsp1β、Nsp7、Nsp12、ORF3和ORF7能够显著抑制IFN-α诱导地ISRE报告基因的表达。其中Nsp1β和ORF7分别是非结构蛋白和结构蛋白中抑制最为显著的病毒蛋白。5.比较来源于不同PRRSV毒株的Nsp1β和N蛋白对I型IFN下游信号通路的抑制作用。克隆以上所提到的6个毒株和Shaanxi-2毒株的Nsp1β，比较发现，除MLV Nsp1β外，其余毒株的Nsp1β都能抑制IFN-α诱导的ISRE报告基因、ISG56和STAT2的表达。并且，比较不同毒株的N蛋白发现，所有克隆得到的N蛋白均表现出对IFN-α诱导地ISRE报告基因和STAT2的表达起抑制作用。6. Nsp1β抑制ISGF3向细胞核转运的机制研究。I型IFN可诱导细胞内形成ISGF3，它经核转运进入细胞核内激活干扰素激活基因（ISGs）的表达。已知PRRSV的感染和Nsp1β的表达可以阻断ISGF3向细胞核转运，从而抑制IFN下游信号通路。本实验通过免疫共沉淀的方法发现，Nsp1β影响了KPNA1与ISGF3复合体中STAT1的相互作用。通过检测Nsp1β表达的细胞内KPNA1的mRNA水平和蛋白水平，发现Nsp1β对KPNA1的转录水平没有影响，但可以导致细胞内KPNA1蛋白水平降低，这种降低又可被蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。进一步研究发现，Nsp1β可以增强KPNA1的泛素化，缩短KPNA1的半衰期。这表明Nsp1β是通过增强细胞内KPNA1的泛素化来加剧蛋白酶体对KPNA1的降解作用，从而影响到KPNA1对ISGF3的细胞核转运，最终抑制I型IFN下游信号通路，影响IFN诱导的ISGs的表达。当我们用全病毒感染MARC-145细胞时，发现VR-2385和VR-2332可以导致细胞内KPNA1的降解，而MLV对KPNA1的表达没有影响。这一结果与这三个毒株Nsp1β在细胞内单独表达时对KPNA1表达的影响结果一致。7. Nsp1β氨基酸序列中引起KPNA1降解的关键氨基酸位点的确定。构建表达Nsp1β不同片段的真核表达载体（D1～D4），分析发现Nsp1β N端结构域（前55个氨基酸）与KPNA1的降解有关。对VR-2385和MLV Nsp1β的氨基酸第19位进行互换，发现VR-2385Nsp1β突变体失去了诱导KPNA1降解的能力，并且对I型IFN下游信号通路的抑制作用也消除了；而突变后的MLV Nsp1β则表现出能够引起KPNA1的降解。这一结果表明，Nsp1β的第19位氨基酸与Nsp1β引起KPNA1的降解及其对I型IFN下游信号通路的抑制作用解密切相关。