论文部分内容阅读
孕酮在哺乳动物雌性生殖活动中发挥了非常重要的作用，孕酮的生理功能主要是通过孕酮受体（Progesterone receptor, PGR）介导的。孕酮受体基因敲除小鼠模型已经证实PGR基因对于哺乳动物雌性生殖功能的重要性，尤其在排卵中发挥了不可替代的作用。近年来，通过基因芯片实验已经筛选出了大量PGR的下游基因，但至今未能在这些下游基因的启动子区域上找到传统意义上的孕酮响应元件。ADAMTS-1和Cathepsin L曾被认为是PGR基因在卵巢中介导卵泡壁破裂的关键信号分子，但这两种蛋白如何受PGR基因的调控以及其在卵泡壁破裂中发挥了什么样的作用，一直还不清楚。本实验以性未成熟的雌性昆明小鼠为研究对象，用外源促性腺激素（PMSG/hCG）诱导小鼠超排卵，用实时荧光定量PCR研究PGR、ADAMTS-1和Cathepsin L mRNA在围排卵期卵巢中的表达变化，发现ADAMTS-1mRNA表达量在PMSG注射后24h开始有显著增高，一直持续到hCG注射后4h，在hCG注射后12h又进一步有显著性的增高，而hCG注射后12h正好是小鼠的排卵时刻，这说明ADAMTS-1不仅在卵泡发育过程中有重要作用，更在排卵过程中发挥了关键作用；并且，ADAMTS-1mRNA表达量在小鼠排卵时刻的进一步增高是发生在PGRmRNA表达量达到最大值之后，这说明很可能是PGR诱导了ADAMTS-1在小鼠排卵时刻表达量的突然性增高。相反，在整个外源促性腺激素处理小鼠的过程中，卵巢中Cathepsin L mRNA表达量一直没有显著变化（P>0.05），说明Cathepsin LmRNA在卵巢中主要以组成性表达为主，外源促性腺激素并不能引起Cathepsin LmRNA在整个卵巢水平的变化。进一步，用孕酮受体拮抗剂RU486来处理小鼠，在hCG注射后12h检测卵巢中基因mRNA的表达，发现RU486能显著抑制外源促性腺激素对ADAMTS-1表达的刺激作用（P <0.05），这说明外源促性腺激素对ADAMTS-1mRNA在小鼠排卵时刻的刺激是由PGR介导的。此外，低氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor1, HIF-1α）和HIF-1β作为已知的在小鼠卵巢中受PGR调节的下游基因，它们以异源二聚体的形式（即HIF-1）来发挥转录因子的功能。而且，在人血管内皮细胞中已经发现HIF-1能直接结合到ADAMTS-1启动子区域。因此，我们自然而然地假设，在小鼠卵巢中，PGR对是通过HIF-1来间接调控ADAMTS-1表达的。为了验证这个假设，我们以方便研究且同时表达PGR、ADAMTS-1、HIF-1α和HIF-1β基因的人乳腺癌细胞系（MCF-7）为研究对象，用不同浓度（10nM、100nM和1μM）的外源孕激素醋酸甲羟孕酮（MPA）处理MCF-7细胞，发现随着MPA浓度的升高，MPA对ADAMTS-1mRNA表达的刺激越来越明显（P <0.05），对HIF-1α和HIF-1β及其典型的下游靶基因VEGFA mRNA的表达虽然也有逐步升高的趋势，但差异并不显著（P>0.05）。在此基础上，用不同浓度RU486（0.1μM、1μM和10μM）处理细胞，发现随着浓度的升高，RU486对ADAMTS-1mRNA表达抑制越来越明显；对HIF-1α、HIF-1β和VEGFA却没有抑制作用；并且，在RU486浓度为10μM时，VEGFA mRNA的表达量反而有极显著性的升高（P <0.01）。这些结果表明，在MCF-7细胞中，PGR同样能够调节ADAMTS-1的表达，但对HIF-1α、HIF-1β和VEGFA却没有明显的调节作用。用氯化钴来模拟低氧环境并刺激细胞中HIF-1α蛋白质浓度的升高，发现氯化钴处理能同时刺激ADAMTS-1mRNA和蛋白质的表达，这说明在MCF-7细胞中，HIF-1同样能调节ADAMTS-1的表达。然而，用MPA和氯化钴同时处理MCF-7细胞，HIF-1α和HIF-1β mRNA无明显变化，但VEGFA mRNA却有显著的升高（P <0.05），而PGR mRNA表达量被显著抑制（P <0.05），同时ADAMTS-1mRNA也有明显的抑制趋势。这说明在MCF-7细胞中，ADAMTS-1的表达主要受PGR的调控，而高浓度的HIF-1α蛋白质却能反过来抑制PGR的表达，并进一步抑制ADAMTS-1的表达。因此，在MCF-7细胞中，PGR对ADAMTS-1表达的调控可能不是由HIF-1介导的，至少不完全是。综上，在小鼠卵巢中，PGR介导了外源促性腺激素对小鼠排卵时刻ADAMTS-1mRNA表达的刺激，但外源促性腺激素并不影响小鼠卵巢中Cathepsin L mRNA的表达。进一步，在MCF-7细胞中，PGR同样能调控ADAMTS-1的表达，但对HIF-1α和HIF-1β这两个已知的在小鼠卵巢中受PGR调节的下游基因无明显的调控作用。