腹腔感染所致脓毒症至今仍是危及生命的临床难题,有着极高的发病率和死亡率。基于液体复苏、感染源控制及抗生素应用的传统治疗并不能有效地改善脓毒症预后。这可能与机体自身免疫功能在脓毒症进展过程中出现的不可逆损害有关。补体系统是机体免疫系统的重要组成部分,它通过复杂的网络联系调控补体各组分蛋白的血浆水平与局部表达,并行使多种免疫功能。大量的研究表明补体参与了感染(如细菌、真菌、病毒、寄生虫等)的早期炎性反应、缺血再灌注损伤、自身免疫性疾病及其它病理改变的调控。然而,目前对补体在严重腹腔感染所致脓毒症的具体作用过程尚不清楚,补体各组分在脓毒症进展各阶段的水平变化及其作用也未有报道,更为重要的是补体对感染后期细胞免疫的调节机制有待揭示。本课题首先通过脓毒症动物模型观察严重腹腔感染时补体C3耗竭与不良结局的相关性,同时评价外源性补体C3在严重腹腔感染不同阶段给予对脓毒症结局产生的不同效果;接下来,深入研究脓毒症早期炎性反应与补体水平变化的相关性,进一步明确早期给予外源性C3补充在改善脓毒症预后中的重要作用;最后通过病理生理机制研究掲示补体C3调节细胞免疫功能的可能途径。这一系列研究将有利于了解补体系统在脓毒症进展中的具体变化与作用,也为寻找脓毒症的有效免疫干预措施提供理论基础。全文共分如下三部分:第一部分外源性补体C3在脓毒症不同时期给予的疗效评价研究目的:补体激活是脓毒症早期天然免疫的重要组成部分。补体持续激活可能是导致脓毒症后期补体耗竭进而进入免疫抑制的重要原因。外源性补体应用于脓毒症治疗的疗效尚不明确。本研究将系统评价外源性补体C3在脓毒症治疗中的作用,并寻找可能的最佳治疗时间。研究方法:采用14G支撑管对C57BL/6J雌性小鼠制作升结肠置管腹膜炎(CASP)模型诱导脓毒症。手术随机分组为:假手术组(支撑管缝于肠壁而不刺入肠腔)、CASP+人纯化补体(HuC3,1mg,I.P.)组和CASP空白(PBS液,200μL,I.P.)对照组,其中C3治疗组按治疗时间细分为4亚组。术后生存率、细菌负荷、重要脏器损伤评价、C3系统水平等用于疗效评价和最佳治疗时相的选择依据。结果:CASP诱导脓毒症可导致补体C3快速耗竭,造成广泛的器官损伤和细菌感染。外源性补体C3早期应用可暂时稳定脓毒症时机体C3水平,增加机体的细菌清除能力,减轻炎性反应对重要脏器的损伤,显著降低死亡率。外源性C3在脓毒症后期应用与CASP对照组有着相似的不良结局。此外,外源性C3补充可刺激机体内源性C3的合成。CASP术后6小时补充补体可能是CASP诱导脓毒症治疗的最佳时相点。结论:本研究明确了外源性补体C3在脓毒症治疗中的重要作用。外源性C3在脓毒症早期使用可以明显减轻多脏器损伤,改善脓毒症预后。第二部分持续脓毒症时补体C3耗竭对炎性反应的影响与相关性分析研究目的:脓毒症至今仍是危及生命的临床难题。脓毒症的形成与补体激活、耗竭密切相关。本部分研究动态观察持续脓毒症时补体及炎性因子水平的改变,并评价了外源性补体C3补给对脓毒症早期炎性反应的影响。研究方法:使用14G支撑管对野生型C57BL/6J雌性小鼠制作升结肠置管腹膜炎(CASP)模型诱导持续脓毒症。实验分组为:假手术组(支撑管缝于肠壁而不刺入肠腔)、CASP+人纯化补体(HuC3,1mg,I.P.)组和CASP空白(PBS液,200μL,I.P.)对照组。观测各组术后48小时内存活率、补体蛋白C3、补体因子H(CFH)及炎性因子各时相点血浆水平,并对腹腔各象限灌洗液、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏及血液离体行细菌培养。线性回归分析C3与CFH、TNF-α相关性。结果:假手术组48小时内无小鼠死亡,补体及炎性因子水平均正常。相对于CASP空白对照组,术后6小时补充C3可使脓毒症后24小时死亡率从60%降至20%,48小时死亡率从94.3%降低至60%。腹腔感染后C3血浆水平短暂升高,6小时后迅速下降,并伴随TNF-α及IL-10的迅速释放。术后6小时给予外源C3可迅速稳定血浆C3水平并维持6小时。持续脓毒症时C3与CFH、急性期TNF-α水平的变化相关(R2=0.600,P<0.001;R2=0.895,P<0.001)。结论:持续脓毒症时以C3为代表的补体呈快速耗竭状态,这与脓毒症早期急性炎性反应时促炎因子的迅速释放相关。在脓毒症急性反应期给予外源性C3可暂时稳定血浆C3水平,从而增强细菌清除能力,改善脓毒症预后,但不可逆转补体耗竭的结局。第三部分持续脓毒症时外源性补体C3上调T细胞免疫的机制研究研究目的:补体系统对天然免疫和适应性免疫的桥接作用已在多同病原体入侵机体时得到证实。然而,补体在脓毒症时究竟通过何种途径影响以T细胞为主的适应性免疫应答仍不清楚。本部分研究拟通过外源性补体C3治疗间接观察脓毒症时补体对T细胞免疫的可能调控途径。研究方法:选用野生型C57BL/6小鼠制作升结肠置管腹膜炎模型(CASP)诱导脓毒症。术后6小时,治疗组小鼠给予腹腔注射人纯化补体蛋白C3(HuC3,1 mg/只),对照组与假手术组则给予磷酸缓冲盐(PBS,200 μL/只)。在干预后各时相点,比较各组补体C3与炎性因子水平,Foxp3与NF-κB表达水平以及CD4+T细胞亚群比例的差异。结果:CASP诱导脓毒症可诱发TNF-α和IL-10的大量释放,并导致补体C3的快速耗竭。相对于CASP对照组,外源性C3治疗可显著提高脓毒症后48小时存活率(40%vs.5%,P<0.01)。脓毒症时Foxp3的表达较假手术组显著增强,但HuC3治疗可明显抑制其表达。另外,单次补充HuC3可延缓Th1细胞比例的下降,同时抑制Th2及Th17分化,而脓毒症后期出现的Th1-Th2漂移也能得有效控制。HuC3治疗可增强脓毒症后期NF-κB表达,而CASP对照组出现的免疫妥协与NF-κB抑制相关。结论:本研究证实了外源性补体C3在脓毒症时上调适应性免疫应答的重要作用。补体调控通路可能通过NF-κB信号途径下调调节性T细胞活性,从而影响T细胞免疫。