骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是骨科一种常见的退行性疾病,常见于老年人,OA的特征性改变是关节软骨进行性退变、软骨细胞凋亡、软骨下骨重建、炎症/滑膜炎和骨赘形成,引起关节疼痛并最终导致关节功能障碍。全球约有2.5亿人正在遭受OA的困扰,在我国60岁以上人群OA发病率高达60%,尤其是在社会老龄化日趋加重的今天,OA发病率逐年增加且大大影响患者的生活质量。在未来几十年,科学家预测OA将会成为导致功能性残疾的主要原因,已成为骨科学研究领域重要的课题,因此OA已经被公认为是一个严重的社会问题,值得广泛关注。尽管目前对关节软骨的生理、病理特性以及关节软骨细胞的代谢功能有了一定程度的认识,但OA的发病机理仍不十分明确。OA研究的目标是寻找可以预防、延缓或终止疾病进展的新的治疗策略,然而很不幸的是,由于该疾病的多因素和复杂性,目前国内外这些干预措施的研究进展具有高度的挑战性。到目前为止,学术界和医学界的联合努力未能将具有令人信服的功效和高安全性的缓解性抗OA药物应用到日常临床中。目前,除了镇痛处理和终末期外科手术之外,没有较为有效的治疗方法,因此,对于OA的病因和治疗的研究仍是世界性难题。研究发现关节软骨本身并没有血运,因此软骨一旦发生退行性变,其自身修复再生能力匮乏,这就要求我们研发出一类能够抑制软骨退变,促进软骨修复、革新和再建关节结构的药物,才能够从根本上解决OA治疗的瓶颈,也正因如此,关节结构改善类药物治疗OA的研究越来越热门。近年来,关节结构改善类药物的代表是甲壳素及其衍生物,壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的一级衍生物,是目前研究最多、应用领域最广的代表。壳寡糖(Chitosanoligosaccharides,COS)是壳聚糖的酶解产物,除了具有壳聚糖的一般特性外,其还具有良好的水溶性。壳寡糖对OA的预防和治疗目前很少被人关注,其作用于软骨细胞分子水平及动物模型的实验研究目前仍然缺乏。在本课题研究中,我们首先评估了壳寡糖对软骨细胞的细胞毒性,进一步研究了其在体外及体内对大鼠OA软骨细胞的作用,旨在探讨壳寡糖对OA关节软骨的保护作用,为OA的预防和治疗提供一种新的思路,并进一步研究其生物学功能可能的分子机制。第一部分壳寡糖体外软骨细胞毒性实验研究[目的]探讨运用体外软骨细胞毒性实验来评估壳寡糖的生物安全性。[方法]取4～6 d龄Sprague-Dawley乳鼠(由武汉大学医学部动物实验中心提供),无菌操作下取双侧膝关节软骨组织,利用酶消化法分离软骨细胞进行体外原代培养,并对软骨细胞进行免疫组化染色及免疫荧光染色鉴定。选取第二代或第三代软骨细胞进行实验,将壳寡糖同软骨细胞共培养,调整其终浓度为50、100、200 μg/ml,共培养24、48及72 h后通过细胞毒性检测试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测壳寡糖的细胞毒性。[结果]取材培养的原代细胞4～6h出现贴壁,72 h生长状态良好,镜下可见细胞融合成片生长,形态呈铺路石状或多角形外观;经Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色证实培养的细胞为软骨细胞。CCK-8检测结果表明壳寡糖在50～200 μg/ml浓度范围内共培养24、48及72 h对体外培养的软骨细胞均无细胞毒性(P>0.05)。[结论]壳寡糖对体外培养的软骨细胞无细胞毒性,具有生物安全性能良好的特点,为进一步体外及体内实验提供依据。第二部分壳寡糖体外抗软骨细胞凋亡作用的实验研究[目的]探讨壳寡糖对体外IL-1β诱导软骨细胞凋亡的保护作用。[方法]取4～6 d龄SD乳鼠(由武汉大学医学部动物实验中心提供),无菌操作下取乳鼠双侧膝关节软骨组织,利用酶消化法分离软骨细胞进行体外培养。选取第二代或第三代软骨细胞进行实验,将壳寡糖(50μg/ml、100μg/ml及200 μg/ml)加入贴壁的软骨细胞中预处理2h后,然后加入终浓度为10ng/mLIL-1β共培养24h。具体实验内容包括:1、CCK-8增殖抑制试验;2、FCM流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况;3、Hoechst 33342荧光染色观察分析软骨细胞核形态改变情况;4、Rhodamine-123染色检测线粒体膜电位变化情况;5、Western blot检测软骨细胞凋亡蛋白 Bcl-2,Bax,p38,p-p38 和 caspase-3 表达水平;6、Real-timePCR 检测软骨细胞内iNOS、MMP-13及TIMP-1 mRNA表达水平。[结果]CCK-8结果表明,壳寡糖对软骨细胞活力具有良好的保护作用;FCM检测结果表明壳寡糖可降低IL-1β诱导的软骨细胞早期和晚期凋亡率(P<0.05);Hoechst 33342染色的细胞核的形态学分析显示相似的结果,结果表明,IL-1β降低核染色质的染色强度,并且在COS共处理后改善了细胞核损伤(P<0.05);Rhodamine-123结果表明壳寡糖能一定程度阻止IL-1β诱导的软骨细胞线粒体膜电位的塌陷(P<0.05);Western blot检测结果表明,壳寡糖显著增加了软骨细胞中Bcl-2/Bax蛋白的比例,与此同时以剂量依赖性方式降低p-p38和caspase-3蛋白表达(P<0.05);Real-time PCR检测结果表明,壳寡糖以剂量依赖性方式降低软骨细胞iNOS mRNA和MMP-13 mRNA的表达,同时以剂量依赖性方式升高TMMP-1 mRNA表达(P<0.05)。[结论]壳寡糖抗IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的机制主要是通过调控p38 MAPK信号转导通路,COS可能有潜力作为预防和治疗OA的独特生物制剂。第三部分壳寡糖对大鼠OA模型关节软骨保护作用的实验研究[目的]建立合理的大鼠OA模型,用于评估和研究壳寡糖对大鼠OA关节软骨的治疗效果,为OA寻找一种新的有效治疗方法。[方法]选取36只成年雄性SD大鼠,随机分成三组:单一造模组(OA组)、壳寡糖治疗组(COS组)和假手术组(CON组)。除CON组仅行右侧膝关节腔显露外,其余两组均切断右侧膝关节前交叉韧带及内侧半月板部分切除构建大鼠OA模型。术后第4周CON组及OA组关节腔注射生理盐水50 ul,COS组关节腔注射1 mg/mL壳寡糖50 ul;每周重复一次,持续注射5周。术后第11周处死动物,比较各组大鼠股骨内髁关节软骨的大体形态变化,取材后行HE及番红固绿染色检查软骨的病理变化并进行软骨改良Mankin’s组织学评分,同时通过扫描电镜观察各组大鼠股骨内髁关节软骨的形态变化。最后应用Western blot和Real-Time PCR检测软骨蛋白和RNA,并分析各组Bax、Bcl-2、p38、p-p38、Caspase-3及iNOS的表达情况。[结果]大体观察可见OA组右膝关节软骨颜色无光泽、表面不平整伴骨赘形成,提示造模成功。同时COS组右膝关节软骨面完整性良好、未见明显骨赘形成,关节软骨退变的病理程度和骨赘的严重程度明显较OA组明显减轻。三组软骨损伤的改良 Mankin’s 评分在 CON 组为 1.5±0.4、OA 组为 9.6±1.6、OA 组为 3.8±1.8,COS组Mankin’s评分较OA组显著降低,两组比较差异具有显著统计学差异。扫描电镜进一步证实了软骨退变的病理程度的改变情况。在关节软骨相关蛋白及RNA表达方面,COS组较OA组中Bax、p-p38、Caspase-3及iNOS表达水平明显降低,而Bcl-2表达水平明显升高(P<0.05)。[结论]关节腔注射壳寡糖可以减轻软骨退变的病理程度,为研发OA治疗药物奠定了实验基础及理论依据。