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流感病毒因其宿主广泛,易变异,且可跨物种传播,故其防治形势越来越严峻。近年来,流感病毒频繁爆发,其中2009年源于北美的新型甲型H1N1流感,每年全球致死数己达上万人,目前H1N1已成为人与人传播的主要流行性毒株之一。H1N1感染会导致原发性病毒性肺炎、急性肺损伤和呼吸衰竭,并导致死亡。此外,H1N1感染还介导了肠道炎症反应。“金银花-连翘”(下简称为“银翘”)药对因其清热解毒的功效常用于温病的治疗。以“银翘”药对为君药的银翘散等制剂在临床上可用于治疗甲型H1N1引发的病毒性肺炎。本文综合运用代谢组学、脂质组学、肠道菌群16s rRNA测序技术,从H1N1感染小鼠的肠内容物、血浆和肺组织着手,从肠道菌群结构及肠道菌代谢物、血浆代谢物及肺表面活性物质三个角度探索“银翘”药对对H1N1肺炎小鼠肺、血、肠代谢的调控作用,进而研究“银翘”药对治疗H1N1肺炎小鼠的作用机制。采用C57BL/6小鼠滴鼻给予H1N1鸡胚尿囊液的方法建立H1N1肺炎模型,以小鼠体重、肺指数、肺组织病理及细胞因子(肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6))的水平为考察指标,评价病毒性肺炎模型及“银翘”药对治疗药效。药效学实验结果表明,“银翘”药对对于H1N1肺炎具有良好的治疗作用。采用气质联用技术(GC-MS)和16s rRNA技术对小鼠肠道菌群及其与宿主共代谢物进行了分析。短链脂肪酸含量测定结果表明,“银翘”药对不通过改善短链脂肪酸的代谢发挥治疗H1N1肺炎的药效。采用16s rRNA技术对小鼠粪便的肠道菌群组成进行分析发现,H1N1肺炎小鼠的肠道菌群紊乱,从细菌门分类水平比较空白对照组、H1N1肺炎组和“银翘”药对给药组三组间小鼠肠道菌群组成发现,肠道菌群主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门及其他菌构成。其中各组小鼠肠道菌群在拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门及其他菌门均无显著性差异。而在蓝细菌门下,“银翘”药对给药组小鼠肠道菌群与H1N1肺炎组小鼠相比,显著减少。从属分类水平上看,嗜胆菌属(Bilophila)、真杆菌属 coprostanollgenes([Eubacterium]coprostanollgenes group)、Family XIII UCG-001、Oscillibacter、红螺菌科(Rhodospirillaceae_uncultured)、Ruminiclostridium及Ruminiclostridium 9共七类肠道菌群在H1N1肺炎小鼠体内发生显著性变化。除Family XIII UCG-O01属菌群外,“银翘”药对对其余六类肠道菌群菌起到回调作用,并具有显著性。表明“银翘”药对抗菌作用导致肠道内短链脂肪酸的合成减少,但可能通过改变其他代谢物水平,发挥治疗作用。基于GC-MS的非靶向代谢组学分析发现,共有24个肠道菌与宿主共代谢物水平紊乱,即天冬氨酸、乙醇胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、次黄嘌呤、肌苷、异亮氨酸、乳酸、赖氨酸、甲醇磷酸盐、草酸、代脯氨酸、苯丙氨酸、磷酸盐、脯氨酸、硬脂酸、苏氨酸、胸腺嘧啶、色氨酸、尿嘧啶、尿酸、缬氨酸和黄嘌呤。其中,发现10个在“银翘”药对作用下显著回调的代谢物,涉及氨酰基-tRNA生物合成、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢通路。相关性研究表明,代谢物甘氨酸、硬脂酸、尿酸、肌苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黄嘌呤、乙醇胺、草酸、磷酸盐和色氨酸,与菌群间均具有强相关性,为关键代谢物。推测“银翘”药对可通过改善关键代谢物,尤其是甘氨酸代谢水平,通过“肠-肺”轴发挥治疗H1N1肺炎的作用。采用气质联用技术对小鼠血浆进行了非靶向代谢组学分析。研究发现,血浆细胞因子水平在H1N1感染后显著升高,而在“银翘”药对作用下显著降低。通过偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)描绘各组代谢轮廓,以VIP>1,Fold Change(FC)>1.5和P<0.05筛选病毒性肺炎介导的小鼠血浆差异性代谢物,涉及17种代谢物,即黄嘌呤核苷、黄嘌呤、反式-4-羟基-L-脯氨酸、苏糖醇、塔洛糖、核糖、脯氨酸、磷酸盐、肌醇、L-半胱氨酸、乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、甘油酸、环亮氨酸、β-羟基丁酸、氨基丙二酸和5-甲氧基吲哚-3-乙酸。“银翘”药对可调控其中13种代谢物及另外4种代谢物的水平包括甘氨酸而发挥治疗H1N1肺炎的作用,主要涉及3条代谢通路,即半乳糖代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢及酮体的合成和降解代谢。分别采用GC-MS技术和液质联用(LC-MS)对小鼠肺组织进行了代谢组学分析。通过主成分分析(PCA)描绘各组代谢轮廓,以FC>1.5和P<0.05筛选肺炎介导的小鼠肺组织差异性代谢物。代谢组学部分,小鼠肺组织中2-羟基吡啶、3-磷酸甘油酸、阿拉伯糖醇、天冬酰胺、咖啡酸、左旋肉碱、脱氢抗坏血酸、甘氨酸、月桂酸、L-犬尿氨酸、肌醇、鸟氨酸和山梨糖醇在H1N1肺炎影响下代谢紊乱,而“银翘”药对一定程度回调代谢物紊乱的状态,通过影响极长链脂肪酸的β氧化、肉碱合成及甘氨酸和丝氨酸代谢通路,发挥治疗H1N1肺炎的作用。脂质组学部分,肺炎引起显著改变的脂质主要有酰基肉碱(ACar)、己糖神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇(HexCer-NS)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、甘油三酯(TAG)、游离脂肪酸(FA)、己糖神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘氨醇(HexCer-NS)和氧化脂肪酸(OxFA)。“银翘”药对可通过调节各类脂质水平如TAG、PC、PE、PG及不饱和脂肪酸等发挥保护小鼠肺部表面活性脂质稳态作用,进而起到治疗H1N1肺炎的作用。综合研究结果表明,H1N1感染的小鼠在“肺-血-肠”轴上存在代谢物代谢紊乱的状态,而“银翘”药对可通过促进小鼠肠道对甘氨酸的吸收,增加甘氨酸血中暴露量,进而使肺组织中甘氨酸含量增加,发挥抗炎、抗氧化作用,最终发挥治疗H1N1肺炎的作用。