本研究旨在探讨联合应用全反式维甲酸(RA)和NT—3诱导皮肤源性前体细胞(SKPs)向神经元样细胞分化及其可能机制，并利用腺病毒(Adv)作载体转染NT—3基因进入SKPs联合RA诱导后移植入大鼠全横断脊髓内观察其在体内的存活和分化情况。为临床上移植细胞替代治疗中枢系统神经损伤提供新的治疗策略和实验依据。本研究分为以下四部分： (一)皮肤源性前体细胞的体外分离培养、纯化及其分化潜能检测 目的：建立一套成熟而稳定的大鼠SKPs的培养方法为本课题后面的研究提供稳定的细胞来源，并对其干细胞特性作以鉴定。 方法：取新生大鼠背部皮肤剪碎，胰酶消化后机械吹打胰酶消化的皮肤组织分离细胞，CO2培养箱中培养。取第3代培养增殖形成的细胞球，做Nestin、Sox2和Fibronectin免疫组化染色；消化打散成单细胞分化14天后做MAP—2、GFAP、Tuj1和NeuN染色。 结果：SKPs当传至第3代时形态较均一，基本纯化；SKPs表达神经干细胞的标志性蛋白Nestin和Sox2同时表达皮肤源性标志蛋白Fibronectin；SKPs自然分化条件下可以分化为MAP—2/Tuj1和MAP—2/NeuN阳性细胞以及GFAP阳性细胞，但神经元样细胞分化率较低。 结论：成功培养的SKPs具有自我增殖和分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞特性，但体外分化为神经元样细胞较少。 (二)体外RA和NT—3联合对SKPs诱导分化 目的：体外检测RA和NT—3是否能诱导SKPs向神经元样细胞分化，以及各自的最佳诱导浓度和联合诱导方法。 方法：用不同浓度的RA(10-8M～10-5M)诱导P3代SKPs7天，然后更换普通分化培养液继续分化7天，同时设RA诱导14天对照组，免疫组化检测SKPs分化为MAP—2和Tuj1阳性细胞率，确定最佳诱导浓度。然后以RA最佳诱导浓度诱导SKPs7天后再给与不同剂量(5ng/ml～40ng/ml)NT—3继续分化7天，同时设NT—3单纯作用14天分化组，免疫组化检测SKPs分化为MAP—2和Tuj1阳性细胞率，确定NT—3最佳诱导剂量。 结果：RA可以促进SKPs分化为更多的神经元样细胞而且和诱导浓度相关，延长RA作用时间超过7天后并不能促进SKPs的神经元样分化；10-6M对SKPs的诱导作用最佳。RA和NT—3联合可以更好的促进SKPs的神经元样分化，20ng/ml和NT—3联合诱导作用最佳；NT—3单独作用并不能促进SKPs的神经元样分化。 结论：RA(10-6M)诱导SKPs7天后再联合应用NT—3(20ng/ml)7天可以诱导更多的SKPs向神经元样细胞分化；延长RA作用时间和单独应用NT—3都不能促进SKPs的神经元样分化。 (三)RA联合应用NT—3诱导SKPs向神经元样细胞分化的可能机制 目的：探讨RA联合应用NT—3诱导SKPs向神经元样细胞分化的可能机制。 方法：利用Western blot检测RA诱导后NeuroD、p21、p75NTR和TrkC在SKPs中的表达变化，流式细胞仪检测RA诱导后SKPs的细胞周期变化，BrdU标记RA诱导后SKPs的分裂增殖变化，利用p75NTR的抑制剂(K252a)和TrkC的抑制剂(Pep5)结合诱导后SKPs神经元样细胞分化率、凋亡和存活率探讨RA和NT—3的可能作用机制。 结果：RA作用24h后就促进SKPs高表达NeuroD，而且随时间延长逐渐降低；随后RA促进SKPs表达p21并在第5天达到峰值随后下降；RA促使大量SKPs停滞在G0/G1期，相应S期和G2/M期细胞明显减少；BrdU标记率在RA作用下比对照组明显降低；RA可以促进SKPs细胞表达p75NTR上调，而对TrkC影响不大；p75NTR抑制剂Pep5可以降低RA联合NT—3对SKPs的神经元样分化的促进作用，而K252a(TrkC抑制剂)作用不明显；RA诱导SKPs分化的同时促进了细胞凋亡，NT—3联合RA作用可以降低细胞的凋亡率和促进分化细胞的存活，此种作用可以被Pep5所抑制，而K252a影响不明显。 结论：RA通过提高SKPs的NeuroD表达来促进更多细胞向神经元方向分化；RA随后上调p21来抑制细胞的分裂增殖并促使细胞分化；RA同时上调p75NTR的表达并诱导细胞凋亡，NT—3可以和p75NTR结合抑制RA诱导的细胞凋亡促进分化细胞的存活。 (四)联合应用NT—3基因重组腺病毒转染和维甲酸预诱导的皮肤源性前体细胞在大鼠全横断脊髓内的存活和分化 目的：探讨联合应用NT—3基因重组腺病毒转染和RA预诱导的SKPs移植入大鼠全横断脊髓损伤后的存活和分化。 方法：首先在体外利用腺病毒转染GFP基因进入SKPs决定最佳转染MOI值，然后以最佳MOI值转染NT—3基因进入SKPs，体外免疫组化检测NT—3的分泌，收集AdvNT—3-SKP细胞的培养液作用于大鼠背根节神经细胞，检测其分泌蛋白能否促进背根节神经细胞的轴突生长。体外RA作用于腺病毒转染的SKPs检测其神经元样细胞分化率。RA诱导腺病毒转染后的SKPs移植入全横断大鼠脊髓，存活64天后灌注固定，脊髓组织切片作MAP—2、Tuj1和NeuN等免疫组化染色，激光共聚焦显微镜观察移植细胞的存活和分化情况。 结果：腺病毒可以成功将目的基因转染入SKPs，最佳MOI值为200；转染NT—3后的SKPs可以表达NT—3阳性蛋白，而且其分泌液可以促进背根节神经细胞的轴突生长。RA作用于转染NT—3基因的SKPs在体外可以促进其分化为更多的神经元样细胞。移植的SKPs可以在大鼠全横断脊髓内存活至少64天，体外RA诱导可以促进体内移植细胞更多的分化为神经元样细胞，转染NT—3基因的SKPs在体内存活更多，其中联合RA诱导组分化为神经元样细胞明显高于其余各组。激光共聚焦显微镜作3D扫描显示这些MAP—2影响的移植细胞同时表达其它的神经元标志性蛋白如Tuj1或NeuN。 结论：RA诱导腺病毒转染NT—3基因的SKPs可以促进其在大鼠全横断脊髓内存活和分化为更多的神经元样细胞。