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目的尿路结石为临床常见病、多发病,对患者造成巨大的痛苦,且复发率高,其发病机制尚未完全阐明。排石冲剂是湖北中医名家的验方,配伍严谨,临床疗效确切。本研究以草酸钙结石大鼠为模型,基于P38MAPK信号通路,观察排石冲剂对草酸、草酸钙结晶所致大鼠肾脏氧化应激与炎症损伤、肾脏局部RAS系统的改变和肾脏细胞紧密连接改变的影响,探讨排石冲剂干预草酸钙结石形成的具体作用机制,为其进一步开发应用提供理论支持和实验依据。方法1动物分组、造模与取材1.1动物分组与造模48只雄性SPF级Wistar大鼠(体重180g-220g),随机分为A、B、C、D组,A组(空白组),12只(普通大鼠饲料喂养及生理盐水灌胃,1ml/100g/次,1次/天),B组(模型组),12只(普通大鼠饲料喂,1%乙二醇自由饮水和2%氯化铵溶液灌胃,lml/100g/次,1次/天),C组(排石冲剂组),12只[临用前将排石冲剂配成0.58g/ml的混悬液(按照体表面积折算接近临床人用量),造模同时予中药混悬液灌胃,1ml/100g/次,1次/天],D组(枸橼酸钾组),12只(边造模边予枸橼酸钾灌胃,25%枸橼酸钾溶液lml/100g/次,1次/天)。1.2取材实验第4周时,将大鼠置于代谢笼收集其24h尿液,将其分为四份并标记。分别用真空采血管采集血标本,4℃冰箱隔夜静置后,留取淡黄色的上清液(血清),﹣80℃冰箱保存备用。摘取大鼠肾脏,右肾置4%甲醛溶液中固定;左肾标记后置入液氮,后移入﹣80℃冰箱保存备用。2标本检测2.1生化检查用收集的尿液标本分别检测尿草酸、尿生化(尿钙、磷、镁),分离备用的血清标本检测BUN、Cr水平,以了解排石冲剂对结石形成的理化危险因素和肾功能的影响。2.2病理切片将固定备用的肾组织标本做成石蜡切片,观察肾脏结晶沉淀及肾脏病理学改变(Von Kossa’s染色)。2.3免疫组化法检测各组大鼠肾组织MCP-1、TGF-β1、AngⅡ、ACE、ACE2、AT1R及p38MAPK/p-p38MAPK、occludin、ZO-1的蛋白表达。2.4 Real Time PCR检测各组大鼠肾组织TGF-β1、MCP-1、AngⅡ、AT1R、ACE、ACE2及p38MAPK、occludin、ZO-1m RNA表达。2.5 Western blotting检测各组大鼠肾组织p38MAPK、occludin、ZO-1蛋白表达。结果1大鼠一般情况、体质量情况、尿液、血清生化及肾脏形态学改变1.1大鼠一般情况:B组大鼠第4周时表现出食欲衰减,活动减少,毛发枯槁,身体蜷缩等现象,其饮水及尿量减少。而D组和C组大鼠,尿量增加,精神状况较好,饮食活动未受明显影响,C组较D组一般情况更佳。1.2大鼠体质量情况:大鼠体重治疗前差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠治疗后体质量比较。治疗后体重情况:与A组比,B组、C组体重较低,差异有统计学意义(P<0.01)。和B组比较,C组、D组体重较高,差异有统计学意义(P<0.01)。1.3尿液、血清生化:B组大鼠尿草酸、钙、磷离子水平较A组均明显升高,尿镁水平则明显降低。B组大鼠血清BUN、Cr水平较A组升高。与B组比较,C组、D组大鼠尿草酸、钙、磷离子水平降低,尿镁水平升高;BUN、Cr水平也较B组降低。1.4肾脏形态学改变:肾组织Ca Ox结晶评分,B组和C组、D组Ca Ox结晶评分均显著高于A组(P<0.01);与B组比,C组、D组评分明显较低(P<0.01)。2排石冲剂通过干预P38MAPK信号通路对大鼠氧化应激和炎症损伤的影响:B组SOD水平降低,MDA水平增高;p/p-p38MAPK、MCP-1和TGF-β1 m RNA和蛋白表达水平增高,C组MDA、p/p-p38MAPK、MCP-1和TGF-β1等指标表达均降低,SOD水平增高。提示排石冲剂可能通过干预P38MAPK通路减轻草酸、草酸钙晶体诱导的大鼠肾脏氧化应激和炎症损伤。3排石冲剂通过干预P38MAPK信号通路对大鼠肾脏局部RAS系统改变的影响:B组较A组p/p-p38MAPK、Ang II和AT1R、ACE m RNA和蛋白水平均升高,ACE2m RNA和蛋白表达水平降低。C组较B组p38MAPK、Ang II和AT1R、ACEm RNA和蛋白水平均降低,ACE2m RNA和蛋白表达水平升高。提示排石冲剂可能通过干预P38MAPK通路影响草酸、草酸钙晶体诱导的大鼠肾脏局部RAS系统的改变,减轻大鼠肾脏损伤并抑制结石形成。4排石冲剂通过干预P38MAPK信号通路对大鼠肾脏紧密连接蛋白改变的影响:B组较A组p/p-p38MAPK蛋白和m RNA表达升高,ZO-1和occludin蛋白和m RNA表达则较A组均降低;C组较B组p/p-p38MAPK蛋白和m RNA表达降低,ZO-1和occludin表达较B组升高,提示排石冲剂可能通过干预P38MAPK通路影响草酸、草酸钙晶体诱导的大鼠肾脏紧密连接的改变。结论排石冲剂可能通过干预P38MAPK通路影响草酸、草酸钙晶体诱导的大鼠肾脏氧化应激和炎症损伤反应、肾脏局部RAS系统改变、肾脏紧密连接的改变,从而起到抑制草酸钙结石形成和保护肾脏的作用。