背景骨肉瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤,转移发生早,预后差。目前临床上对骨肉瘤的治疗多采用手术、化疗等综合治疗,虽然五年生存率较前有明显提高,但疗效仍不满意。大剂量化疗带来的严重副反应以及多药耐药等问题使得骨肉瘤的治疗难以完全治愈。基因治疗可能成为那些已丧失手术时机患者的新的治疗手段。研究表明,肿瘤细胞恶性增殖,死亡的减少与肿瘤的发生、发展的密切相关。并且使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因而,诱导肿瘤细胞死亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。自噬性细胞死亡是一种不同于凋亡、不依赖caspase的程序性细胞死亡。有研究表明自噬的抑制与肿瘤的发生有关,沉默自噬基因Beclin1可导致多种恶性肿瘤的发生,是一个候选的肿瘤抑制基因。因此,我们认为,骨肉瘤的Beclin1表达状况的研究是极具研究价值的课题。Beclin1基因可能成为骨肉瘤基因治疗更具针对性的目的基因,研究自噬基因Beclin1在骨肉瘤细胞中的表达状况以揭示其在骨肉瘤发生、发展的意义,对于揭示骨肉瘤的发病机理,并寻找针对这一顽疾的新的治疗策略,具有十分重大的意义。为此我们进行了以下三部分实验研究。第一部分Beclin1基因在人成骨肉瘤细胞株MG63和人成骨细胞株hFOB1.19中mRNA及蛋白表达的差异性目的明确人成骨肉瘤细胞MG63以及人成骨细胞hFOB1.19中自噬基因Beclin1的表达差异情况,探讨其与骨肉瘤发生、发展的关系。方法采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印记法(Western blot),对人成骨肉瘤细胞MG63及成骨细胞hFOB1.19中Beclin1 mRNA及蛋白的表达水平进行检测。结果人成骨肉瘤细胞MG63中Beclin1 mRNA及蛋白表达水平明显降低,其表达水平显著低于对照组人成骨细胞hFOB1.19。结论自噬基因Beclin1在骨肉瘤细胞中表达异常与骨肉瘤的发生、发展有关。第二部分Beclin1基因真核表达质粒的构建、转染及鉴定目的构建携带自噬基因Beclin1cDNA的真核表达质粒,瞬时转染并在人成骨肉瘤细胞MG63中表达,为骨肉瘤的基因治疗奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶,酶切构建并鉴定pEGFP/Beclin1真核表达质粒,脂质体转染法瞬时转染体外培养的骨肉瘤细胞株MG63细胞,荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印记法(Western blot)来检验目的基因及其蛋白表达情况。结果重组真核表达质粒pEDFP/Beclin1中插入序列由大连宝生物公司测序核实,证明重组质粒连接正确,经定量RT-PCR检测表达质粒转染人成骨肉瘤细胞株MG63后,Beclin1 mRNA在人成骨肉瘤细胞MG63同空质粒转染组及未转染的人成骨肉瘤细胞MG63的相对拷贝量明显增加,Western blot检测转染后人成骨肉瘤细胞MG63中Beclin1蛋白明显高于空质粒转染组和未转染细胞组。结论成功地构建了pEGFP/Beclin1真核表达质粒,并能在人成骨肉瘤细胞中表达Beclin1 mRNA,为骨肉瘤的基因治疗提供了必要的条件。第三部分外源性人Beclin1基因转染对人成骨肉瘤细胞MG63体外生长的抑制作用目的研究外源性人Beclin1基因在人成骨肉瘤细胞MG63中过表达对其体外生长的抑制作用和对甲氨碟呤化疗敏感性以及细胞自噬的影响。方法应用重组质粒pEGFP/Beclin1,以脂质体转染法转染体外培养的人成骨肉瘤细胞株MG63,以pEGFP及空白转染组为对照,应用MTT法分析外源性Beclin1过表达对人成骨肉瘤细胞株G63增殖的影响,并用流式细胞仪检测凋亡率的变化和对MTX的化疗疗效的影响。应用MDC染色观察转染细胞自噬情况结果pEGFP/Beclin1转染人成骨肉瘤细胞MG63后细胞增殖有明显减慢,较PEGFP转染组和未转染组两者之间差异有显著性(P＜0.05)。pEGFP/Beclin1转染72小时后人成骨肉瘤细胞MG63的凋亡率高于对照组,差异有显著性(P＜0.05)。转染组较对照组增殖率减弱,(P＜0.05)。转染组发生自噬的细胞数目明显增加。结论自噬基因Beclin1的过表达可抑制人成骨肉瘤细胞MG63的增值并诱导其凋亡,自噬增加。能提高骨肉瘤细胞对甲氨碟呤的化疗敏感性。