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目的:通过层析法从眼镜蛇毒中分离高纯度高生物活性的细胞毒素-1(CTX-1)和细胞毒素-2(CTX-2),以人肝正常细胞(HL7702)为对照探索CTX-1和CTX-2对人肝星状细胞(HSC-LX2)是否有选择性抑制作用及CTX-1对HSC-LX2细胞周期、细胞形态及超微结构、PI3K/AKT信号通路的影响,从而阐明CTX-1通过阻滞细胞周期抑制HSC-LX2细胞增殖并通过PI3K/AKT信号通路诱导HSC-LX2细胞凋亡的机制。方法:依次应用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Spehadex G-50凝胶层析和Macro-prep High S阳离子交换层析来对眼镜蛇毒细胞毒素进行分离纯化。用SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度并采用NanoLC-ESI-MS/MS蛋白质谱法鉴定蛋白质成分及其分子量大小。采用CCK-8法检测不同浓度的CTX-1和CTX-2对HSC-LX2和HL7702细胞增殖的影响。采用流式细胞术检测CTX-1干预后HSC-LX2细胞周期的变化与CTX-1对HSC-LX2和HL7702细胞凋亡的影响。通过透射电镜观察CTX-1干预后HSC-LX2细胞形态与超微结构的变化。采用Western blot技术检测CTX-1作用于HSC-LX2细胞不同时间后(0、3、6、9、12 h),PI3K/AKT信号通路中AKT蛋白磷酸化水平的变化;以及最小有效浓度的CTX-1、PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002(50μmol/L)、CTX-1联合LY294002分别作用HSC-LX2细胞后AKT蛋白磷酸化水平的变化。结果:眼镜蛇毒粗毒经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Spehadex G-50凝胶层析和Macro-prep High S阳离子交换层析分离纯化后得到电泳纯且具有高生物活性的蛋白质,经NanoLC-ESI-MS/MS蛋白质谱鉴定分别为CTX-1和CTX-2。CTX-1分子量约为9.499 KDa,得率为1.76%,CTX-2分子量约为9.548 KDa,得率为3.73%。CCK-8结果显示,不同浓度的细胞毒素作用24 h后,对HSC-LX2和HL7702两种细胞均有增殖抑制作用,增殖抑制率都随浓度增加而增大,呈剂量-效应关系。CTX-1抑制HSC-LX2增殖的最小有效浓度为0.5μg/ml,IC50为2.50μg/ml;CTX-1抑制HL7702增殖的最小有效浓度为8μg/ml,IC50为18.97μg/ml。CTX-2抑制HSC-LX2增殖的最小有效浓度为0.5μg/ml,IC50为1.213μg/ml;CTX-2抑制HL7702增殖的最小有效浓度为0.5μg/ml,IC50为1.253μg/ml。流式细胞术结果显示,CTX-1作用HSC-LX2细胞24 h后,随着药物浓度增加,S期百分比升高,G1、G2期百分比均下降。CTX-1对HSC-LX2和HL7702两种细胞均具有诱导凋亡作用,凋亡率随浓度增加而升高,呈剂量-效应关系。CTX-1诱导HSC-LX2凋亡的最小有效浓度为2μg/ml;诱导HL7702凋亡的最小有效浓度为4μg/ml。通过透射电镜观察发现阴性对照组中HSC-LX2细胞形态结构正常,无明显凋亡表现;CTX-1干预组中HSC-LX2细胞数量减少,可见胞质空泡化,染色质凝聚、边集,细胞核碎裂,出现凋亡小体等细胞凋亡的特征性形态学改变。2μg/ml的CTX-1作用于HSC-LX2不同时间后,各时间点的AKT蛋白表达量没有明显变化,磷酸化AKT蛋白的表达量则随作用时间的延长而降低。50μmol/L的LY294002、2μg/ml的CTX-1作用于HSC-LX2细胞后,AKT蛋白表达量没有明显变化,磷酸化AKT蛋白的表达则被显著抑制,两者联用的效果最佳。结论:眼镜蛇毒粗毒经层析分离获得电泳纯且具有高生物活性的细胞毒素。与HL7702细胞相比CTX-1对HSC-LX2细胞的细胞毒性更强,选择性地抑制HSC-LX2细胞增殖并诱导其凋亡。CTX-1可将HSC-LX2细胞阻滞于S期从而抑制其增殖,并通过降低磷酸化AKT蛋白的表达,抑制PI3K/AKT信号通路的激活而诱导HSC-LX2细胞凋亡。