基于转录组与代谢组研究象草花青素积累机制

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象草(Pennisetum purpureum)隶属于禾本科(Gramineae)狼尾草属(Pennisetum Rich),广泛种植于亚热带和热带地区,有产量高、管理粗放、利用期长等优点,是我国南方重要的牧草。目前象草的基因组数据有限,极大的限制了其遗传育种的相关研究,丰富象草基因信息可加快其分子生物学的研究。紫色象草(P.purpureum cv.Purple)植株高大、根系发达,茎杆和叶片呈紫红色,在牧草植物中较为少见。前人研究表明,花青素的合成与积累是叶片呈现紫色性状的主要原因,而花青素对植物和人类均有积极作用。本试验通过对紫色象草、摩特矮象草(P.purpureum cv.Mott)进行转录组测序+研究,丰富狼尾草属植物的基因信息;利用转录组数据开发大量EST-SSR标记,为狼尾草属植物遗传育种研究提供技术和方法;通过转录组和代谢组联合分析,进一步挖掘叶色相关的功能基因和代谢产物,为深入研究单子叶植物叶色形成与关键基因提供启示。主要研究结果如下:1、象草转录组从头测序研究及分子标记开发。采用高通量测序技术对紫色象草和摩特矮象草的叶片进行转录组测序,建立转录组数据库。6个象草样本共获得了50,756,372个高质量数据,利用Trinity得到了284,875条转录本,平均长度为781 bp,N50值为1354 bp;通过拼接得到了197,466条unigenes,平均长度为586 bp,N50值为833 bp。对unigenes进行功能注释,其中103,454条可以注释到至少一个数据库中,12,195条在7个数据库中均可注释。在Swiss-Prot、Pfam、Nr、Nt、KEGG、KOG和GO数据库中分别注释了54,026条(27.35%)、55,245条(27.97%)、72,485条(36.7%)、74,148条(37.54%)、25,683条(13%)、28,665条(14.51%)和56,999条(28.86%)unigenes。象草转录组数据得到了大量的EST-SSR位点,利用这些位点开发EST-SSR引物,并用狼尾草材料验证其可行性。在18,587条unigenes中共检测到了21,213个EST-SSR位点,重复序列的长度范围为1-6 bp。随机选取50对EST-SSR引物对17份狼尾草材料进行扩增,其中20对引物可扩增出清晰的条带。试验共得到128条条带,其中121条为多态性条带,平均每对引物可扩增出6.4条条带,平均多态信息含量(PIC)、基因多样性(H)和香农指数(I)分别为0.3347、0.3689和0.5405。对17份狼尾草材料进行遗传多样性分析,材料可聚为3类,但不能通过聚类完全分开,种类之间的差距不太明显。2、基于转录组测序分析紫色象草的花青素积累机制。用P<0.05进行筛选,与绿色叶片相比,在紫色和浅紫色叶片中分别发现了9,074和10,028个差异基因。紫色和浅紫色叶片与绿色叶片相比,分别有4,329和5,548个上调基因,4,745和4,480个下调基因。两类比较中,分别有4,092个和4,324个差异基因可注释到GO数据库中;共843和700个差异基因富集到118个KEGG途径中。在象草中共发现了涉及类黄酮途径、花青素生物合成途径以及黄酮和黄酮醇生物合成途径的176个基因。在这些基因中,134个基因注释到类黄酮生物合成途径中,其中133个为差异基因,16个差异基因的表达水平有显着变化,包括上游基因(CHS、DFR等)和下游基因(ANR等)。这些差异基因注释为CHS、CYP73A、CCo AOMT、F3H、DFR、HCT、ANR、CYP98A、ANS、F3’H和ANS。为证明转录组测序数据的可信度,本研究利用qRT-PCR对4个差异基因和2个差异转录因子进行验证,结果表明,定量PCR中6个基因的表达趋势与转录组结果相符合。3、基于代谢组分析紫色象草的花青素积累机制。为研究象草紫色叶片的形成机理,对紫色象草和摩特象草进行转录组和代谢组联合分析。其中,木犀草素、山柰酚、槲皮素、锦葵素、芹菜素、天竺葵素和矢车菊素的含量均有差异。由于锦葵素在紫色象草中的高表达量和其与紫色色素的相关性,它可能是象草紫色叶片形成的主要花色素。在类黄酮合成途径中的16个差异表达基因中,CHS、CYP73A、CCo AOMT、F3H、ANR、DFR和ANS的基因表达量在紫色象草和摩特象草之间均有差异,这些基因是紫色叶片形成和积累的候选基因。在3种不同颜色的叶片样本中共发现了47个差异表达的转录因子(TF),包括24个MYB和23个b HLH。与摩特象草相比,紫色象草中有15个上调和12个下调的转录因子。此外,在11个差异表达基因和41个转录因子中分别发现了55个SNP和231个SNP,这些SNP可能在基因表达调控中有重要作用。
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