【摘 要】
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黑莓栽培品种’Arapaho’和黑树莓野生种质插田泡是可在我国南方地区推广应用的非常有潜力的悬钩子属植物。由于悬钩子属植物基因组信息缺乏,本课题首先以插田泡3个不同发育时期果实为材料,通过转录组测序的手段获得了丰富的表达序列信息;结合课题组前期研究基础,比较了插田泡和黑莓中UGT78H2编码蛋白的差异;对黑莓UGT78H2蛋白进行体外重组表达和酶促动力学分析,探明其作为糖基转移酶的催化活性,并讨论
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黑莓栽培品种’Arapaho’和黑树莓野生种质插田泡是可在我国南方地区推广应用的非常有潜力的悬钩子属植物。由于悬钩子属植物基因组信息缺乏,本课题首先以插田泡3个不同发育时期果实为材料,通过转录组测序的手段获得了丰富的表达序列信息;结合课题组前期研究基础,比较了插田泡和黑莓中UGT78H2编码蛋白的差异;对黑莓UGT78H2蛋白进行体外重组表达和酶促动力学分析,探明其作为糖基转移酶的催化活性,并讨论了该糖基转移酶的底物识别机制。本试验主要的研究结果如下:1、获得了插田泡3个代表性发育阶段的果实转录组序列。179,738,287条125 bp的高质量原始序列拼接去冗余后获得了95,845个参考转录本序列。鉴定了植物UGT家族的转录本,并分析了这些转录本的表达情况。2、从转录本中筛选出课题组前期从黑莓中鉴定的UGT78H2的同源蛋白。序列分析发现两个UGT的蛋白质序列一致性为97.82%。两者的PSPG结构域一致性达100%,且在PSPG结构域中均存在两个重要的保守氨基酸突变位点。3、UGT78H2属于植物糖基转移酶F类群。分子对接结果表明UGT78H2和保守位点突变的序列（标记为m UGT78H2（A360P,K380N））的最佳底物是槲皮素和UDP-葡糖醛酸。构建p GEX-UGT表达载体,经原核表达获得的体外重组蛋白为包涵体。另构建p EAQ-UGT和p EAQ-m UGT真核表达载体,转化至本氏烟草获得可溶性重组蛋白。4、HPLC检测与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定表明,黑莓UGT78H2蛋白以槲皮素为糖基受体,不仅可以催化UDP-半乳糖生成槲皮素-3-O-半乳糖苷(Kcat/Km=0.7681 s-1×m M-1);还可以催化UDP-葡糖醛酸生成槲皮素-7-O-葡糖醛苷(Kcat/Km=0.9117 s-1×m M-1)。m UGT78H2（A360P,K380N）以槲皮素为糖基受体,可以催化UDP-葡萄糖生成槲皮素-4-O-葡萄糖苷(Kcat/Km=0.9155 s-1×m M-1);亦可以催化UDP-半乳糖生成槲皮素-3-O-半乳糖苷(Kcat/Km=1.002 s-1×m M-1);还可以催化UDP-葡糖醛酸生成槲皮素-7-O-葡糖醛苷(Kcat/Km=0.9722 s-1×m M-1)。以上试验结果表明,插田泡和黑莓中的UGT78H2在关键氨基酸位点发生的改变,影响了UGT78H2对糖基供体的识别特异性与催化活性。
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