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神经病理性疼痛是由于躯体感觉系统的损伤或疾病所导致的疼痛,临床发病率较高,表现为持续性自发痛、痛觉超敏和痛觉过敏。神经系统痛觉传导通路兴奋性增高常被认为是产生神经病理性疼痛的基础,包括外周敏化和中枢敏化,而神经元自发异位电活动被认为是外周敏化的基础之一。M通道在调节神经兴奋性方面发挥重要作用,它是一种阈电位附近激活的非失活的钾电流,能抑制神经元反复放电,稳定膜电位,控制神经元兴奋性。开放M通道(KCNQ基因编码,又称Kv7通道)将引起细胞膜超极化从而降低细胞神经元兴奋性,M通道开放剂可治疗癫痫、焦虑、精神分裂症和偏头痛、神经病理性疼痛、炎性痛等神经兴奋性相关的疾病。QO-58lysine是经过高通量筛选发现的一个具有自主知识产权的新化合物,作用靶点为Kv7/M通道。QO-58对Kv7.1-Kv7.5各亚基均有不同程度的开放作用,对Kv7.2/7.3的开放作用最强。前期对QO-58lysine的药效学观察中,发现QO-58lysine有一定抗癫痫和镇痛作用,现拟对QO-58lysine的镇痛机制及作用的效果进行观察,包括外周坐骨神经损伤诱发病理性疼痛、三叉神经痛和糖尿病神经病理性疼痛,为进一步新药开发提供依据。目的:液质联用技术测定QO-58lysine在大鼠DRG和TG神经元中分布的浓度;膜片钳技术分析QO-58lysine对DRG和TG神经元M电流的影响;观察药物对神经病理性疼痛动物模型的治疗作用。方法:(1)100 mg/kg QO-58lysine灌胃7天后,分离大鼠DRG和TG组织。液质联用测定组织中药物浓度。(2)原代培养SD大鼠的DRG和TG神经元,采用全细胞膜片钳方式,记录中小直径神经元细胞的M电流。然后给予不同浓度的QO-58lysine溶液,观察其对M电流的作用。(3)通过CCI手术建立外周神经损伤致神经病理性疼痛模型,25 mg/kg、50mg/kg、100mg/kgQO-58lysine重复给药后测量机械刺激缩足阈值(mwt)和热刺激缩足潜伏期(twl),评价其治疗作用。(4)通过ion-cci手术建立三叉神经痛模型,25mg/kg、50mg/kgQO-58lysine重复给药后测量mwt,评价其治疗作用。(5)60mg/kg腹腔注射2%stz,建立stz致糖尿病神经病理性疼痛模型,12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kgQO-58lysine重复给药后测量50%mwt,评价其治疗作用。(6)免疫组化分析DRG和tg中kcnq3蛋白的表达变化。结果:(1)DRG组织中QO-58lysine含量为13.16±7.76μg/mg;tg组织中QO-58lysine含量为8.89±1.48μg/mg。(2)QO-58lysine可激活m通道。1、3、10、100μmQO-58lysine增大DRG神经元m电流的倍数分别为0.43±0.03、0.65±0.11、1.59±0.63、2.17±0.14(n=3-6),ec50为7.1μm。与给药前相比,p<0.001,均具有显著性差异。0.01、0.1、1、3、10、30、100μmQO-58lysine增大tg神经元m电流的倍数分别为0.09±0.005、0.24±0.09、0.36±0.16、0.73±0.16、1.46±0.24、1.92±0.20、2.30±0.05(n=3-8),ec50为9.3±3.3μm。与给药前相比,p<0.001,均具有显著性差异。(3)建立cci模型,造模成功率为85%,术后第8天灌胃给药,测mwt和twl。模型组在术后第13天mwt值和twl值最低(分别为14.9±2.3g;8.8±0.6s)。阳性药普瑞巴林pgb组在术后第13、15、17天,mwt值(分别为23.9±4.6g、25.3±4.2g、26.2±3.9g)和twl值(11.6±1.6s、11.8±0.8s、11.5±1.1s)均有显著提高(p<0.001或p<0.05)。QO-58lysine25mg/kg组在术后第13、15天mwt值分别为22±7g、24.4±4.5g;术后第13、15、17天twl值分别为10.9±1.6s、10.7±1.2s、10.5±1s,与模型组相比均有显著提高(p<0.01或p<0.05)。QO-58lysine50mg/kg组在术后第13天mwt值为19.8g±4.9g;第13、17天twl值分别为9.7±1.1s、10.1±1.3s,与模型组相比均有显著提高(p<0.05)。QO-58lysine100mg/kg组在术后第15天mwt值为24.2±3.7g;第13、15、17天twl值分别为10.1±0.7s、10.3±0.7s、10.2±0.7s,与模型组相比均有显著提高(p<0.01或p<0.05)。(4)建立三叉神经痛模型,术后第10天灌胃给药。与模型组相比,在术后第14、17、21、28天,卡马西平组MWT(分别为1.43±0.64 g、3.50±1.91 g、3.6±2.19 g、11.2±3.6 g),QO-58lysine 25 mg/kg组MWT(分别为1.43±0.64 g、2.8±1.10 g、2.16±1.07 g、7.33±2.3 g),QO-58lysine 50 mg/kg组MWT(分别为1.45±0.74 g、1.83±1.06 g、1.70±0.33 g、8.8±1.8 g)均有显著提高(P<0.01或P<0.05)。(5)建立STZ致糖尿病神经病理性疼痛模型,造模成功率为68%,造模后第22天灌胃给药。STZ造模后第28、31天,与模型组50%MWT(分别为3.24±0.62 g、3.43±0.44 g)相比,阳性药普瑞巴林PGB组50%MWT(分别为13.72±4.92 g、11.54±3.82 g)、QO-58lysine 12.5 mg/kg组50%MWT(分别为8.25±3.83 g、9.36±4.83 g)均有显著提高(P<0.05或P<0.01)。STZ造模后第28天,QO-58lysine 25 mg/kg组50%MWT(8.05±4.76 g)有显著提高(P<0.05)。造模后第31天,QO-58lysine 50mg/kg组50%MWT(6.89±3.41 g)有显著提高(P<0.05)。(6)免疫组化结果显示,KCNQ3蛋白在神经元细胞膜上表达。直径较大的神经元上表达较少或不表达,中小直径神经元呈强表达。与对照组(平均光密度为0.180±0.04)相比,模型组的表达明显降低(平均光密度为0.161±0.03),(P<0.05)。与模型组相比,PGB组、QO-58lysine12.5 mg/kg和50 mg/kg组的表达增强(分别为0.216±0.01、0.188±0.01、0.184±0.005),有显著性差异(P<0.001或P<0.05)。结论:灌胃给药后,QO-58lysine在大鼠DRG和TG神经元有一定的浓度分布;QO-58lysine能够增大DRG和TG神经元上的M电流,对坐骨神经痛、三叉神经痛和糖尿病神经病理性疼痛大鼠有明确疗效,并能提高糖尿病神经病理性疼痛模型大鼠DRG和TG神经元KCNQ通道表达。QO-58lysine通过调节M通道,可以达到治疗神经病理性疼痛的作用。