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抗生素在农业生产中的应用引起了动物源食品中的残留问题。其中氨基糖苷类(碱性、强极性)和大环内酯类(碱性、弱极性)抗生素由于其特殊的理化性质导致其在分离分析中存在较大难题,主要有氨基糖苷样品前处理的选择性与回收率问题、亲水作用色谱分离选择性问题,以及大环内酯峰形拖尾问题。本论文针对食品中氨基糖苷和大环内酯类抗生素残留问题对两类抗生素的样品前处理、色谱分离和高灵敏度检测方法展开研究。针对氨基糖苷样品前处理选择性及回收率问题,采用巯基-烯烃自由基加成反应合成了一种弱阳离子交换固定相TGA,并基于TGA发展了二维正交固相萃取(2D-SPE)方法用于氨基糖苷类抗生素的富集净化。将C18填料和TGA填料分段装填到SPE柱中,氨基糖苷在SPE柱上依次经过反相离子对模式和弱阳离子交换模式的保留,经过两步柱头富集、两步淋洗和两步洗脱,提高了样品的富集选择性。该方法较传统一维SPE表现出更低的基质效应和更高的回收率,实现了牛奶基质中氨基糖苷类抗生素的高灵敏度检测。针对亲水作用色谱模式下氨基糖苷分离选择性问题,发展了基于两性离子固定相Click TE-Cys的高选择性亲水色谱分离方法。分离条件优化结果显示高浓度缓冲盐、低pH条件更利于改善氨基糖苷的分离选择性和色谱峰形。结合吸附和分配模型对其保留行为进行考察,结果表明氨基糖苷在Click TE-Cys柱上的保留更倾向于吸附保留机理,即氨基糖苷与Click TE-Cys固定相之间的直接作用力(如氢键作用、静电作用)是影响分离的重要因素。在优化的色谱条件下,Click TE-Cys实现了10种氨基糖苷类抗生素以及大观霉素相关杂质的高选择性分离。同时,Click TE-Cys在亲水作用色谱模式下对多种无机离子也具有很好的分离选择性,可用于成盐药物中反荷离子的定量测定。针对反相色谱模式下大环内酯类抗生素峰形拖尾的问题,发展了基于表面正电荷修饰C18HCE固定相的高效色谱分离方法。C18HCE柱与大环内酯之间的电荷排斥作用改善了色谱峰形,大大提高了质谱的检测灵敏度。梯度柱效计算结果显示表面正电荷修饰反相固定相分离碱性化合物时,电荷排斥作用的存在导致流动相敏感程度变高,宜采用梯度模式进行洗脱。发展的分离方法最终成功应用于蜂蜜基质中大环内酯残留的定量检测,实现了蜂蜜基质中7种大环内酯残留的高灵敏度检测。采用极性共聚键合技术合成了一种新型反相-弱阳离子交换色谱固定相C18SAX,C18基团与季铵基团以比例可控的方式键合到硅胶表面,色谱评价显示C18SAX固定相表现出典型的反相和强阴离子交换作用。在HPLC指导下开发了基于C18SAX材料的SPE方法用于关木通提取液中马兜铃酸类化合物的选择性富集,并实现了4个马兜铃酸化合物的纯化制备。