蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifoliaL.、东方香蒲Typha orientalis Presl.或同属植物的干燥花粉。该药长于收敛止血,兼有活血化瘀之功,有止血不留瘀的特点,用于吐血、咯血、崩漏、尿血等,亦可用于跌打损伤、痛经、产后疼痛、心腹疼痛等淤血作痛者。蒲黄为临床常用中药,既可内服,也可外用,且该药毒副作用小,有较好的应用前景。蒲黄生品性滑,偏于活血化瘀止痛,炒炭后性涩,偏于止血。但是临床使用中常常出现处方中蒲黄和炒蒲黄不分或标注不明确的情况,为规范临床合理用药,本文对蒲黄生熟异用的物质基础进行了研究,为蒲黄在临床上的合理使用提供依据。本论文分为四章。第一章为文献研究,总结了蒲黄炮制历史沿革,化学成分、药理作用及临床应用的研究进展。第二章为蒲黄生品、炭品的化学差异性研究,包括蒲黄生品、炭品的形态鉴定,蒲黄炒炭前后化学成分的变化,蒲黄化学成分的研究,蒲黄生品、炭品的HPLC指纹图谱比较及主要黄酮类成分的含量测定。第三章为蒲黄生品、炭品体外抗氧化及凝血实验研究。第四章为蒲黄在复方二神散中的生熟异用。实验研究内容如下:1文献研究查阅相关古今文献,系统整理国内外学者的研究成果及专著论述,对本课题的研究对象蒲黄及蒲黄炭的炮制历史沿革、化学成分、药理作用及临床应用等各方面资料进行综述。2蒲黄生品、炭品的化学差异性研究本文采用OlympusDX60多功能显微镜对蒲黄药材炮制前后的显微结构进行比较研究,结果发现花粉粒的形态有一定变化,炭品花粉粒颜色明显加深,花粉粒皱缩,网状雕纹消失。通过HPLC、UPLC-MS等方法分析比较蒲黄炒炭前后的化学成分,研究蒲黄炒炭前后产生主要变化的化学成分。通过比较分析发现,蒲黄炒炭前后变化最大的是黄酮苷类化合物和苷元化合物的相对含量。炒炭后黄酮苷大多被破坏,黄酮苷元相对含量明显升高。此外,炒炭后会产生一些大极性的小分子组分。通过硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、凝胶柱层析以及HPLC等色谱技术从蒲黄的乙酸乙酯和正丁醇部位中分离并鉴定了 17个化合物,分别为:二十五烷酸(1)、β-谷甾醇(2)、正十九烷醇(3)、柚皮素(4)、香草酸(5)、烟酸(6)、山柰酚(7)、异鼠李素(8)、琥珀酸(9)、槲皮素(10)、胸腺嘧啶(11)、胡萝卜苷(12)、尿嘧啶(13)、香蒲新苷(14)、十八烷酸丙酸醇酯(15)、异鼠李素-3-O-新橙皮苷(16)、蔗糖(17),其中化合物1、3、6、11为首次从蒲黄中分离得到。采用RP-HPLC法梯度洗脱,在对不同产地的蒲黄HPLC指纹图谱研究的基础上,对蒲黄炭进行了 HPLC指纹图谱的研究和分析,其方法简便,重复性好且共有峰较多,并测定了药材中香蒲新苷、异鼠李素-3-0-新橙皮苷和异鼠李素的含量,为蒲黄饮片的质量控制提供了依据。从炮制前后指纹图谱中可以看出,香蒲新苷、异鼠李素-3-0-新橙皮苷的含量显著降低,异鼠李素的含量显著增加,其他色谱峰在量上也有不同程度的变化,可能是蒲黄在制炭后止血作用增强的主要原因。3蒲黄生品、炭品体外抗氧化及凝血实验研究自由基与人体的一些重大疾病有一定的相关性,自由基攻击生命大分子造成机体损伤是诱发血栓、动脉硬化等疾病的重大原因。蒲黄作为化瘀止血药,具有改善微循环、心脑血管功能、血小板及凝血系统等生理功能。从消除DPPH自由基及还原Fe3+能力两个方面对蒲黄生品及炭品的醇提物和水提物的抗氧化活性进行评价比较。结果表明,在所选取的浓度范围内,生品和炭品的水提物及醇提物均对DPPH自由基有显著的抑制作用,并且随着浓度的增加而增强,呈现明显的量效关系,且生品的效果强于炭品。生品和炭品的醇提物对Fe3+具有较强的还原能力,呈剂量依赖关系,且生品的效果强于炭品。实验结果均显示,蒲黄生品的抗氧化能力强于炭品,可能与生品中所富含的黄酮类化合物有关,植物中黄酮类化合物被认为是一种广泛存在的、潜在的抗氧化剂,具有较强的抗氧化活性。炒炭之后黄酮类化合物大量减少,因此其抗氧化的活性也随之降低。采用体外ADP诱导家兔血小板聚集模型和凝血酶时间(TT)法评价蒲黄生品、炭品的作用差异和单体化合物的生物效应,为蒲黄在临床上生熟异用提供药理学实验依据。实验结果表明,蒲黄生品、炭品均能抑制血小板的聚集,而表现出一定的活血化瘀作用,且生品的活血化瘀作用强于炭品。黄酮类单体化合物也具有抗血小板聚集的作用,说明黄酮类成分是蒲黄的活血化瘀主要活性成分之一。同时,蒲黄生品、炭品也能够缩短凝血酶时间,表现出促凝活性,且炭品止血作用强于生品。黄酮类化合物也表现出一定的促凝作用,能显著缩短凝血酶时间。蒲黄生品、炭品均有一定的化瘀止血作用,其止血活性体现在凝血酶原酶形成阶段,炭品强于生品,其化瘀活性表现为抑制血小板聚集,生品强于炭品,这正体现了“生能行血,炒炭止血”这一传统的炮制理论,为蒲黄在临床上的生熟异用提供了科学依据。4蒲黄在复方二神散中的生熟异用4.1蒲黄生品、炭品及复方对血瘀模型大鼠血液流变学及凝血酶活性的影响蒲黄生品能明显降低血瘀模型大鼠高低切变率下全血黏度,使得红细胞变形性增强,而蒲黄炭品及复方没有表现出明显的效果;蒲黄、蒲黄炭及复方能降低血沉值,使得红细胞的聚集性降低,从而表现出一定的改善血液循环作用。在凝血酶原酶形成阶段,蒲黄、蒲黄炭及复方均能缩短血瘀模型大鼠凝血酶原酶形成阶段凝血时间而表现出一定的凝血活性,且炭品及复方的凝血途径要多于生品及复方对照组而表现出优于生品及复方对照组的凝血活性。在纤维蛋白形成阶段,蒲黄、蒲黄炭及复方均能降低血瘀模型大鼠FIB,延长此阶段凝血时间,而表现出一定的活血化瘀功效,且生品在降低FIB方面强于炭品及复方而表现出更强的活血化瘀作用。由于纤维蛋白原含量的高低直接影响着血液流变性指标,FIB越高,血液黏度越大,瘀证越明显。由此可知,蒲黄、蒲黄炭的化瘀作用与纤维蛋白形成阶段、纤溶系统密切相关。4.2蒲黄生品、炭品及复方对血瘀模型大鼠肺部病理性损伤及舌象体征的影响蒲黄生品、炭品及复方都能通过改善血瘀模型大鼠肺泡壁充血、增厚,肺泡腔及肺间质大量出血,炎细胞浸润等途径而对其肺病理组织损伤起到一定的治疗和恢复作用,且复方的效果要强于单味药。根据传统中医理论,血瘀者可见舌象青紫,伴见瘀斑或瘀点。由实验可知,血瘀大鼠舌质紫暗、舌体出现瘀斑瘀点,舌固有层水肿、出血,出现出瘀证体征。预防性给予蒲黄、蒲黄炭及复方后,血瘀大鼠舌象体征明显改善,这间接反映出蒲黄对血瘀大鼠血瘀舌象体征的改善作用。这也是“有诸内必行于诸外”的重要体现。4.3蒲黄生品、炭品及复方对血瘀模型大鼠肺组织中SOD、MDA、NO、NOS的影响蒲黄生品、炭品及复方能够阻止模型SOD活性的降低,降低氧自由基代谢产物的损害,达到调节氧化-抗氧化系统平衡的作用,从而减轻肺组织的损伤。同时,能够显著升高急性血瘀大鼠肺组织中降低的NO、T-NOS及cNOS水平,并降低iNOS水平,故具有保护肺脏,抑制肺损伤的作用。