梅花鹿为东亚特产,是中国一级保护野生动物,被国际自然与自然资源保护联盟(IUCN)红皮书列为濒危物种。梅花鹿全身是宝,集药用、肉用、皮用和观赏用等功能于一身,如鹿茸、鹿血、鹿鞭等药用价值很高。结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌复合群成员引起的人、家畜及野生动物等的一种慢性消耗性人兽共患传染病,被国际动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病之一。
　　鹿结核病的病原大多数是牛型分枝杆菌,多发生于梅花鹿、马鹿、驯鹿、黑鹿、赤鹿等中。本病的传播和流行严重地危害了养鹿业的发展。同时也威胁人类健康和其他动物的安全。为保证养鹿业的发展和人类的健康,应尽快制定控制和防控的有效措施。结核菌素皮内试验(TST)是目前应用最广泛,并且为法定的结核病检疫方法。但是该方法却存在很多弊端:梅花鹿为野生动物,不易捕捉,操作烦琐,费时费力;因个体差异不同导致反应有差异;其结果以皮肤厚度的增加数为准,易造成人为误差,缺乏严格性。
　　本研究克隆、表达和纯化了梅花鹿IFN-γ基因(CerIFN-γ),制备了IFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体,建立了检测梅花鹿IFN-γ的双抗体夹心ELISA方法,并在临床上进行了初步应用。
　　1.梅花鹿IFN-γ的克隆与原核/真核表达通过Con A刺激,从全血培养上清提取CerIFN-γmRNA,根据GenBank上发布的CerIFN-γcDNA序列设计原核表达和真核表达两对引物,扩增出来的cDNA,分别克隆到原核表达载体pET32a和真核表达载体pCI-neo中,构建原核表达重组质粒和真核表达重组质粒,经测序确认后原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出大小为23KU左右的可溶性蛋白,对其进行了纯化。真核表达重组质粒用磷酸钙介导转染牛肾细胞(MDBK)和幼仓鼠肾细胞(BHK-21),通过不同浓度G418依次筛选获得稳定分泌表达的抗性克隆细胞系。
　　2.梅花鹿IFN-γ的生物活性分析为了进一步鉴定本研究所表达的IFN-γ是否具有天然IFN-γ的特性,检测了IFN-γ抑制VSV或IBRV在MDBK细胞系的增殖能力,结果证实,重组CerIFN-γ抗病毒活性分别约为7.25×104U/mL和4.61×104U/mL。对IFN-γ理化特性进行了分析,结果表明CerIFN-γ有较强的耐热性,而耐酸性不十分明显。从而证实,所表达的重组CerINF-γ十分接近天然INF-γ。
　　3.梅花鹿IFN-γ单克隆抗体制备与鉴定本研究利用纯化的原核表达蛋白免疫小鼠,用真核细胞系稳定分泌表达的上清筛选阳性杂交瘤细胞,获得三株高效价的单克隆抗体,分别命名为4C2、1F10和1G10。进一步以杂交瘤细胞诱生小鼠腹水,ELISA检测4C2、1F10和1G10的腹水抗体的ELISA效价分别2.56X104、1.28X104和6.4X103。Western-blot分析显示3株单抗均能特异性结合23KU CerIFN-γ,表明3株单抗均为CerIFN-γ的特异性单抗。为了进一步证实McAb的特异性,通过重组CerIFN-γ抗病毒活性阻断试验检测结果表明,重组CerIFN-γ的抗病毒活性可以有效地被其单克隆抗体阻断,完全阻断100 U的VSV感染性的最低稀释倍数为1:1600,非免疫鼠血清则完全不能阻断重组CerIFN-γ的抗病毒活性,而抗牛重组INF-γ的兔高免血清在1:100稀释时阻断率为46％。
　　4.梅花鹿结核IFN-γ体外释放检测法的建立选取单抗细胞株1C4、纯化的多抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA方法,检测CerIFN-γ,结果表明此ELISA检测的灵敏度达到24.9 pg/ml,特异性好,不与其它检测抗原反应。此ELISA方法为临床应用奠定了基础。
　　5.梅花鹿IFN-γ体外释放检测结核病的初步应用2009年5月-2010年5月在湖北省某鹿场采取330份抗凝血样品。用牛结核抗体检测试纸条(试剂盒)与本研究建立的CerIFN-γ夹心ELISA对上述样本进行平行检测,结果IFN-γ检出阳性率为17％,牛结核抗体检测试纸条检出阳性率为2％,用牛分枝杆菌抗体ELISA检测试剂盒检出阳性率为11.2％,表明CerIFN-γ检测法的灵敏度高于抗体检测法。这些方法具有简便、快速和高通量的特点,在梅花鹿结核病控制方面具有很好的应用前景。