研究背景:　　 肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种神经系统进行性变性疾病，是运动神经元病中最常见的类型。该病选择性侵犯运动神经元，以运动皮质、脑干后组颅神经核和脊髓前角的运动神经元变性、丢失为主要病理特征。临床上，ALS一般在30-60岁隐袭起病，表现为上、下运动神经元受损症状并存，即肌萎缩、肌无力与锥体束征等不同的组合。疾病进行性发展，病人最终因呼吸肌麻痹或并发呼吸道感染而死亡，发病后平均生存时间约3～5年。ALS大多为散发性，大约10％ALS为家族性(Familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS)，其中10-20％fALS由编码铜锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase-1，SOD1)的基因突变所致。目前已建立了数种表达人突变SOD1基因的转基因模型鼠。国际上应用较广泛的是SOD1G93A转基因小鼠，该鼠模型具有和人类ALS疾病相似的临床表现和病理特征，是研究ALS发病机制及相关治疗的理想工具。　　 ALS的发病机制尚不明确，可能的机制包括兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、线粒体功能异常、神经丝蛋白异常磷酸化、凋亡和炎性级联反应等。尽管运动神经元变性、死亡是ALS显著和主要的病理变化，但是越来越多的实验显示星形胶质细胞以及它与运动神经元之间的相互作用在ALS发生和发展过程中起重要作用。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，它的一项重要的生理功能是摄取中枢神经系统中的谷氨酸盐，防止由谷氨酸蓄积对神经元造成的兴奋性毒性作用。而这一功能的实现主要是依赖星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体EAAT2(在鼠类称为GLT-1)，约95％的谷氨酸经由EAAT2转运至星形胶质细胞内。在ALS病人及转基因动物模型中均发现EAAT2选择性减少，并伴有转运体功能的下降，同时这一改变可随疾病进展而加剧。而以EAAT2为靶点的治疗能延缓ALS模型动物的病情发展也从另一个角度表明了该转运体在ALS中的重要作用。　　 目前ALS病因仍不清，发病机制错综复杂，因此临床缺乏有效的、靶点明确的治疗措施。干细胞治疗被认为是一种很有前景的治疗措施。已经证明在成体器官中存在着干细胞，可以作为损伤的代偿机制，在一定条件下这些干细胞能自我更新和增殖分化来修复受损的组织，但在广泛的神经退行性变中，中枢神经系统缺乏这种自我修复功能。在SOD1转基因鼠中发现中枢神经系统内源性神经干细胞功能缺陷，增殖率降低，在症状期神经干细胞表面标志物表达降低，因此人们试图开发新的研究方向利用其他干细胞移植治疗ALS。　　 伦理问题限制了胚胎干细胞的应用。来源问题是神经干细胞最大的挑战。而我们小组以往的实验证实骨髓间质细胞(marrow stromal cells，MSCs)移植治疗ALS小鼠，能在一定程度上延长ALS小鼠的生存期，延缓发病时间，改善症状。近年来研究发现脂肪组织中含有一种具有多向分化潜能的细胞群，称为脂源性干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)，其性质与MSCs十分相似。ADSCs能够向成骨，成软骨，成肌等方向分化，并能分化为神经元和胶质细胞。更重要的是ADSCs在一定的条件下能分泌多种生长因子及抗细胞凋亡因子，而实验表明多种营养因子，如胶质源性神经生长因子、血管内皮生长因子等，均可推迟突变SOD1转基因小鼠发病时间或延长其存活期。在临床应用方面，和MSCs相比取材方便是ADSCs一个最大的优势。一方面脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富，另一方面吸脂手术技术成熟，手术风险小。其次，细胞克隆形成实验表明，ADSCs的获取效率要优于MSCs。由此可见，ADSCs比MSCs更具临床应用潜力。用ADSCs移植治疗ALS的研究目前尚未见报道，但一些新近的研究表明，移植的ADSCs能通过多种机制改善缺血性及出血性卒中模型鼠的症状。　　 研究目的:　　 分离扩增人脂源性干细胞(hADSCs)，体外实验探讨该细胞能否抑制星形胶质细胞GLT-1的丢失。经静脉移植hADSCs治疗SOD1G93A转基因小鼠，观察可否延缓病情进展，延长生存期，对病理、生化等方面进行全面的动态评价，并结合体外实验结果初步探讨hADSCs治疗ALS的相关机制，为hADSCs的临床应用提供实验依据。　　 研究方法:　　 1体外实验　　 1.1动物模型　　 雌性C57BL/6J小鼠与雄性SJL/J小鼠杂交，得到子一代雌性B6SJL。然后用雄性SOD1G93A转基因小鼠与雌性B6SJL小鼠交配，得到的子一代应用PCR鉴定从而获得实验用SOD1G93A转基因小鼠。　　 1.2 hADSCs的分离、培养　　 获取健康志愿者的吸脂手术产物10-50 ml，经过Ⅰ型胶原酶消化，离心后获得的hADSCs用含10％FBS的DMEM培养基重悬，按1×109/L密度接种于T-25培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的C02、饱和湿度的培养箱内培养。72小时后换液一次，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。待上述细胞长到80％～90％融合时，用含有0.01％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化，以1：3的比例传代培养。　　 1.3 hADSCs的免疫表型测定　　 收集第5代hADSCs，PBS洗涤3次，加入荧光标记的大鼠抗人CD29，CD34，CD44，CD45，CD106抗体，用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。　　 1.4 hADSCs的多向分化潜能检测　　 第5代hADSCs生长至70％融合时，分别用成骨诱导、成脂诱导培养基换处理2周。然后分别用茜素红和油红对成骨分化和成脂分化的细胞进行染色，光镜下观察。　　 1.5原代星形胶质细胞分离、培养　　 取出生后2天以内的SOD1G93A转基因小鼠或同窝出生非转基因小鼠，取出脊髓，在解剖显微镜下小心剥离脊膜和血管，轻柔研磨后吹散，300×g离心5分钟，以含10％FBS的DMEM重悬，接种于T-25培养瓶。每2～3天换液一次，约2周后达到融合。震摇法(200rpm，12小时)去除小胶质细胞。胰酶消化后接种于6孔板。　　 1.6星形胶质细胞纯度鉴定　　 1.7 hADSCs与星形胶质细胞相互作用　　 2.体内实验　　 2.1 hADSCs静脉移植SOD1G93A转基因小鼠　　 2.2 hADSCs静脉移植治疗SOD1G93A小鼠疗效观察　　 2.3 hADSCs移植对运动神经元计数及星形胶质细胞活化的影响　　 2.4 hADSCs对SOD1G93A小鼠脊髓微环境的影响　　 取各组16周、21周龄实验鼠各5只。取出脊髓，用ELISA试剂盒检测VEGF、HGF、IGF-1的水平；用Western blot法检测GLT-1、Caspase-3、GFAP蛋白表达水平。　　 2.5 hADSCs在移植鼠中枢神经系统中的植入和表型检测　　 3.统计分析　　 统计分析由软件SPSS13.0 for Windows完成。存活资料应用Kaplan-Meier和Mantel-Cox分析。其它资料的所有数值以均数±标准差表示，应用单因素方差分析或t检验进行统计分析，双侧检验，显著性检验水准为α=0.05。　　 实验结果:　　 1.体外实验结果　　 1.1 hADSCs培养与表面抗原标志　　 1.2 hADSCs成脂、成骨分化　　 1.3原代星形胶质细胞的鉴定　　 1.4 hADSCs对SOD1G93A小鼠星形胶质细胞GLT-1转运体的影响　　 1.5 hADSCs对SOD1G93A小鼠星形胶质细胞Caspase-3的影响　　 1.6 SOD1G93A小鼠星形胶质细胞对hADSCs细胞因子分泌功能的影响　　 2体内实验结果　　 2.1 hADSCs移植对SOD1G93A转基因小鼠发病时间及生存期的影响　　 2.2 hADSCs移植对SOD1G93A转基因小鼠运动功能的影响　　 2.3 hADSCs移植延迟SOD1G93A转基因小鼠运动神经元丢失　　 2.4 hADSCs移植能增加SOD1G93A转基因小鼠脊髓内VEGF、HGF、IGF-1的含量　　 2.5 hADSCs移植减轻SOD1G93A转基因小鼠脊髓星形胶质细胞的活化　　 2.6 hADSCs移植能降低SOD1G93A转基因小鼠脊髓内GLT-1的丢失　　 2.7 hADSCs移植能抑制SOD1G93A转基因小鼠脊髓内Caspase-3的激活　　 2.8 hADSCs能植入SOD1G93A转基因小鼠中枢神经系统并向神经及星形胶质细胞分化　　 结论:　　 ①体外实验表明hADSCs能够上调SOD1G93A转基因小鼠星形胶质细胞GLT-1的蛋白表达，并增强其转运功能；hADSCs的这一种作用可能与其分泌多种细胞因子抑制了星形胶质细胞内Caspase-3的活化有关；并且SOD1G93A转基因小鼠星形胶质细胞可促进hADSCs分泌细胞因子的功能。　　 ②体内实验表明经静脉移植hADSCs能够延缓SOD1G93A转基因小鼠运动神经元的丢失，保护小鼠运动功能，延迟发病及疾病进展，延长小鼠的生存期。　　 ③hADSCs对运动神经元的保护作用可能涉及以下方面：抑制脊髓内Caspase-3的活化；减少GLT-1丢失；抑制星形胶质细胞过度活化；分泌多种细胞因子；向神经和胶质细胞方向分化。