论文部分内容阅读
目的:观察党参多糖（CPPs）对去卵巢大鼠骨质疏松的影响,研究CPPs在骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨/成脂分化中的作用,探讨CPPs对H2O2致小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1）氧化损伤的影响及机制。方法:1.观察CPPs对去卵巢大鼠骨质疏松的影响,采用双侧去卵巢（OVX）手术构建骨质疏松（OP）大鼠模型,48只12周龄的SPF级雌性SD大鼠分为:假手术组（Sham）、去卵巢组（OVX）、雌二醇组（E2,OVX+50μg/kg/d雌二醇）、CPPs低剂量组（CPPs-L,OVX+100 mg/kg/d CPPs）、CPPs中剂量组（CPPs-M,OVX+200 mg/kg/d CPPs）、CPPs高剂量组（CPPs-H,OVX+400mg/kg/d CPPs）,干预12周后收集标本。采用酶联免疫法吸附试验（ELISA）测定血清生化指标;苏木精-伊红（H＆E）染色检测肝脏、肾脏、股骨远端组织形态学;微计算机断层扫描技术（Micro-CT）观察股骨微结构,测定骨小梁骨矿物质密度（BMD）及骨小梁相关参数,如骨组织体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）;抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）检测股骨中破骨细胞数量;免疫组织化学（IHC）法检测股骨中Runt相关转录因2（Runx2）、β-catenin、Pumilio 2（PUM2）的蛋白表达。2.CPPs对大鼠BMSCs成骨/成脂分化的作用及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。全骨髓贴壁法提取SD大鼠的BMSCs,流式细胞术鉴定BMSCs表型。（1）不同浓度CPPs（0、25、50、100μg/m L）干预BMSCs,检测各组BMSCs的成骨、成脂分化相关指标,以及β-catenin的表达情况。（2）加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1,将BMSCs分为对照组、CPPs组（100μg/m L）、CPPs+DKK1（100μg/m L CPPs+500 ng/m L DKK1）组,检测各组BMSCs的成骨、成脂分化相关指标。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）法检测成骨、成脂分化相关因子的m RNA表达;采用蛋白免疫印迹试验（WB）法检测成骨、成脂分化相关因子的蛋白表达;给予成骨分化诱导液培养14、28天,分别采用碱性磷酸酶（ALP）染色法、茜素红染色（ARS）法,观察各组BMSCs的ALP活性及矿化结节;给予成脂分化诱导液培养21天,采用油红O染色（ORO）,观察成脂分化;采用WB和细胞免疫荧光法检测β-catenin在BMSCs中的蛋白表达。3.CPPs对H2O2致氧化损伤下MC3T3-E1细胞功能的影响。检测不同浓度H2O2及CPPs干预MC3T3-E1细胞不同时间对细胞增殖的影响,筛选实验用浓度及时间。（1）观察CPPs对H2O2致MC3T3-E1细胞氧化损伤及线粒体自噬的影响:（1）将MC3T3-E1细胞分为对照组、H2O2（200μM）组、H2O2+CPPs（200μM H2O2+25、50、100μg/m L CPPs）组,检测各组细胞的增殖、成骨分化、凋亡、ROS及线粒体自噬相关蛋白的表达。（2）加入粒体自噬抑制剂环孢素A（Cs A）,将MC3T3-E1细胞分为对照组、H2O2（200μM）组、H2O2+CPPs（200μM H2O2+100μg/m L CPPs）组、H2O2+CPPs+Cs A（200μM H2O2+100μg/m L CPPs+0.4μM Cs A）组,检测各组细胞的成骨分化、凋亡、细胞内ROS水平及线粒体自噬水平。（2）观察CPPs对H2O2致MC3T3-E1细胞氧化损伤过程中PUM2的影响,以及PUM2在CPPs保护成骨细胞氧化损伤中的作用:（1）检测不同浓度H2O2（0、50、100、200、400μM）作用下MC3T3-E1细胞PUM2的m RNA及蛋白表达。（2）采用质粒转染过表达MC3T3-E1细胞中的PUM2,将MC3T3-E1细胞分为对照组（NC组）、阴性质粒组（p Ex-NC）、PUM2质粒组（p Ex-PUM2）,检测各组细胞的成骨分化相关因子的蛋白表达、细胞内ROS水平及线粒体自噬相关因子的表达。（3）将MC3T3-E1细胞分为对照组（NC组）、H2O2（200μM）组、H2O2+CPPs（200μM H2O2+100μg/m L CPPs）组、H2O2+CPPs+p Ex-PUM2（200μM H2O2+100μg/m L CPPs+p Ex-PUM2）组,检测各组细胞的成骨分化功能、细胞内ROS水平、线粒体自噬相关因子的表达。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖;WB法检测成骨分化相关因子（COL I、Runx2）、自噬相关因子（LC3、P62）以及凋亡相关因子（Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2）的蛋白表达;采用ALP、ARS染色法分别检测ALP活性及矿化结节形成情况;流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术结合荧光显微镜检测细胞内ROS水平;免疫荧光法结合荧光显微镜观察细胞内PUM2蛋白表达情况。结果:1.体内实验显示,与Sham组相比,OVX组骨皮质变薄、骨小梁结构变稀疏、骨髓腔内大量空泡,BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著下降（P＜0.05）,Tb.Sp显著增加（P＜0.05）,TRAP染色面积明显增加;与OVX组相比,E2组和CPPs-L组、CPPs-M组、CPPs-H组骨皮质变厚、骨小梁结构变紧密、骨髓腔内空泡减少,BMD、BV/TV、Tb.N也显著增加（P＜0.05）,Tb.Sp显著下降（P＜0.05）,TRAP染色面积明显减少。E2组以上指标与Sham组之间没有显著差异。与Sham组相比,OVX组股骨Runx2、β-catenin表达下降（均P＜0.05）,PUM2表达升高（P＜0.05）;与OVX组相比,E2组和CPPs-L组、CPPs-M组、CPPs-H组Runx2、β-catenin表达升高（均P＜0.05）,PUM2表达下降（P＜0.05）。2.CPPs对大鼠BMSCs成骨/成脂分化的影响。成功提取大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD34、CD45的阳性率分别为96.62%、98.78%、0.27%、0.28%。（1）与对照组相比,CPPs（25、50、100μg/m L）干预,显著增加了BMSCs成骨分化相关因子（Runx2、COL I、ALP、OPN）的m RNA及蛋白表达（P＜0.05）、ALP活性及矿化结节形成;显著抑制了BMSCs成脂分化相关因子（PPAR-γ、C/EBP-α）的m RNA及蛋白表达（P＜0.05）、脂滴形成。（2）加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1后,与CPPs组比较,CPPs+DKK1组成骨分化相关因子（Runx2、COL I、ALP、OPN）的m RNA及蛋白表达显著下降（均P（27）0.05）、ALP活性及矿化结节形成减少,而成脂分化相关因子（PPAR-γ、C/EBP-α）的m RNA及蛋白表达显著增加（均P＜0.05）、脂滴形成增加。3.CPPs对H2O2致氧化损伤下MC3T3-E1细胞功能的影响。（1）CPPs通过增加线粒体自噬减轻H2O2对MC3T3-E1细胞的氧化损伤。（1）与对照组相比,H2O2组MC3T3-E1细胞增殖明显降低（P＜0.05）;凋亡相关因子Caspase-9、Caspase-3、Bax的蛋白表达显著增加（均P＜0.05）,Bcl-2的蛋白表达显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）;成骨分化相关因子Runx2、COL I蛋白表达均显著降低（均P＜0.05）,ALP及矿化结节的形成也减少;自噬相关因子LC3 II/LC3 I蛋白比值显著降低（P＜0.05）、P62蛋白表达显著增加（P＜0.05）;细胞内ROS水平显著增加（P＜0.05）。与H2O2相比,各CPPs（25、50、100μg/m L）干预组凋亡相关因子Caspase-9、Caspase-3、Bax的蛋白表达均显著降低（均P＜0.05）、Bcl-2的蛋白表达显著增加（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;成骨分化相关因子Runx2、COL I的蛋白表达均显著升高（均P＜0.05）、ALP及矿化结节的形成也增加;自噬相关LC3 II/LC3 I的蛋白比值显著增加（P＜0.05）,P62的蛋白表达显著降低（P＜0.05）;细胞内ROS水平显著降低（P＜0.05）。（2）加入线粒体自噬抑制剂Cs A后,H2O2+CPPs+Cs A组较H2O2+CPPs组,LC3 II/LC3 I的蛋白比值显著降低（P＜0.05）,P62的蛋白表达显著增加（P＜0.05）,细胞内ROS水平显著增加（P＜0.05）;细胞凋亡相关因子Caspase-9、Caspase-3、Bax的蛋白表达显著增加（P＜0.05）,Bcl-2的蛋白表达显著下降（P＜0.05）,细胞凋亡率显著上升（P＜0.05）;成骨分化相关因子Runx2、COL I蛋白表达显著下降（P＜0.05）、ALP及矿化结节的形成减少。（2）CPPs通过抑制PUM2过表达缓解H2O2对MC3T3-E1细胞的氧化损伤:（1）与对照组相比,H2O2组（50、100、200μM）PUM2 m RNA及蛋白表达显著增加（均P＜0.05）;与H2O2组相比,CPPs组PUM2 m RNA及蛋白表达显著降低（均P＜0.05）。（2）与NC组及p Ex-NC组相比,p Ex-PUM2组LC3 II/LC3I的蛋白比值显著下降（P＜0.05）,P62蛋白表达显著增加（P＜0.05）;成骨分化相关因子Runx2、COL I的蛋白表达显著下降（P＜0.05）,ALP及矿化结节形成减少。NC组与p Ex-NC组之间无显著差异。（3）H2O2+CPPs+p Ex-PUM组较H2O2+CPPs组,LC3 II/LC3 I的蛋白比值显著下降（P＜0.05）,P62蛋白表达显著增加（P＜0.05）;成骨分化相关因子Runx2、COL I的蛋白表达显著下降（P＜0.05）,ALP及矿化结节形成减少。结论:1.党参多糖减轻去卵巢导致的大鼠骨质疏松,骨皮质增厚、骨小梁结构紧密、骨髓腔内空泡减少、BMD、BV/TV、Tb.N显著增加,且无肝肾损伤及血糖、血脂代谢紊乱。2.党参多糖缓解去卵巢导致的大鼠骨质疏松的机制可能与其增加骨组织内Runx2、β-catenin表达,降低PUM2表达有关。3.党参多糖通过增加BMSCs内β-catenin表达促进BMSCs向成骨细胞分化。4.党参多糖通过抑制PUM2过表达和增加自噬水平减轻H2O2致MC3T3-E1细胞的氧化损伤,抑制细胞的凋亡,促进细胞的成骨分化。