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F蛋白是杆状病毒的一种重要膜蛋白,它分为Fa和Fb两类。Fa是组Ⅱ NPV出芽病毒的膜蛋白,在杆状病毒出芽和病毒感染传播时可以替代GP64重要功能;Fb是组I NPV的跨膜蛋白, GP64被认为在同源进化上取代了Fb的功能。CbNPV(Clanis bilineata NPV)是本实验室新发现的一种杆状病毒;AcNPV(Autographa califionicaNPV)和BmNPV(Bombyx mori NPV)是组I NPV的典型病毒。为了解Fa和Fb的性质、特点和功能,探索Fa、Fb和GP64之间功能上的关系,本论文以这三种病毒为研究对象,通过分析基因序列、荧光定量PCR和GFP荧光蛋白示踪等方法,对Fa、Fb和GP64蛋白进行了初步研究。所得主要结论如下:
1.首次系统地分析了CbNPVFa基因,其读码框由2109个核苷酸组成,编码702个氨基酸,分子质量约为80.69 kDa。它具有早期和晚期的启动子;有膜融合蛋白的结构特点,这些特点与GP64蛋白极为相似。
2.CbNPV F蛋白与几种有代表性的Fa、Fb和GP64蛋白氨基酸序列同源性分析表明,CbNPV F蛋白与Fa的同源性在32.9-61.8%之间,其属于Fa家族;CbNPV F蛋白与GP64及其与Fb的同源性均在20%以下,CbNPV F蛋白与两者的亲缘关系都较差。
3.系统地分析了已知基因组全序列的NPV的Fa、Fb和GP64的同源性,并作出系统进化树状图。分析表明,Fa和Fb的同源性均在20%以下,虽然两者是同源蛋白,但功能可能差别很大。Fa与GP64和Fb与GP64的同源性都很低,表明在系统进化上gp64与F基因的来源可能不同,gp64可能是来自外源基因。同时对它们早、晚期转录起始因子的分析显示,Fb、Fa和GP64都具有早、晚期启动因子;Fb不是进化上的冗余基因,而是有功能的基因。
4.荧光定量PCR和半定量PCR的方法研究AcNPV和BmNPVFb和gp64的表达情况表明:Fb不但是表达的,而且表达的量也呈有规律的变化,证明Fb基因不是进化的冗余基因,而是有功能的基因。Fb和gp64表达量的变化趋势总体相似,但不同种类杆状病毒的Fb相对于gp64的表达趋势变化剧烈程度不同;gp64表达量远远大于Fb的表达量,并且相对于gp64,不同种类杆状病毒的Fb的表达量也有较大差别。推测组I NPV中Fb蛋白和GP64蛋白的功能不相关,Fb的功能与不同种类杆状病毒本身的特性有关。
5.BmNPV Fb的启动子只有在BmNPV病毒激活因子的作用下才能活化,并启动Fb在家蚕细胞中表达,并且Fb蛋白没有分泌性的信号肽,因而在功能上和Fa有较大的差别。
6.首次研究了CbNPV Fa和ie-1基因的表达,两基因均不能在BmN和Tn5细胞中表达,但可以在Spli和Sf9细胞中表达。