背景:认知功能是大脑的高级神经活动之一,是人类和动物获得或应用知识以及信息加工的过程,它包括精神和智力活动的各个方面,学习和记忆是其中最主要的方面。学习记忆是一个由各种神经细胞、神经突触之间相互作用、相互联系形成的复杂的大脑高级活动过程。研究学习记忆的分子机制尤其是疾病导致的学习记忆障碍的机制,将为治疗记忆类疾病和疾病导致的认知能力降低提供新靶点、新思路。条件性味觉厌恶(conditioned taste aversion,CTA)是将味觉刺激与内脏不适感觉相关联的学习过程,是研究学习记忆的经典的条件反射。动物在饮用某种有特殊味觉特征的食物后,随后出现恶心、呕吐、腹泻等内脏不适,当再次遇到相同味觉特征的食物时,便会减少或拒绝摄取该食物。条件反射建立后,动物会长时间记住该食物的特殊味觉特征,因此CTA可以用来研究记忆的一个重要过程:记忆消退(extinction)。由于很多疾病,如脑卒中,可导致创伤后应激综合征(post traumatic stress disorder,PTSD),而记忆消退与此密切相关,因此研究记忆消退的分子机制将有助于记忆相关疾病的诊治。另外,研究表明丘脑、杏仁体、岛叶(Insular cortex,IC)等脑区与CTA密切相关,因此,便于在解剖学基础上进一步研究学习记忆的分子机制。脑卒中是因各种诱发因素引起内动脉狭窄、闭塞或出血而造成的急性脑血液循环障碍,是当前威胁人类生命的三大疾病之一。脑卒中按发病原因可分为出血性和缺血性,其中缺血性脑卒中约占全部卒中的80%,且每年以8.1%的速率不断上升。在我国,70%-80%的缺血性脑卒中患者遗留有不同程度的躯体运动及认知功能障碍,其中认知功能障碍常常干扰患者对外界环境的感知和适应,给患者家庭和社会带来了严重的负担。目前关于缺血性脑卒中后的认知功能,尤其是学习记忆障碍未受到足够重视。学习记忆障碍不仅严重影响患者的日常生活能力,也对躯体感觉运动功能的恢复造成不利影响,是缺血性脑卒中致残的重要原因之一。因此研究缺血性脑卒中后学习记忆障碍的分子机制,及早发现并有效治疗具有重要的医学价值和社会意义。脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是中枢神经系统中含量最丰富、分布范围最广的神经营养素家族成员,且在与认知功能密切相关的脑区如海马、皮层、纹状体等表达较高。BDNF不仅对神经元的存活、分化、生长和损伤修复具有重要作用,还参与学习记忆等多种生物学功能。随着脑损伤修复机制研究的不断深入,证据表明神经可塑性是脑卒中功能恢复的基础。而BDNF对神经元可塑性起着重要的调控作用,BDNF合成后通常储存在突触的致密核心囊泡(dense core vesicle,DCV)中,它必须从中分泌释放,并与其高亲和力酪氨酸激酶受体B(TrkB)结合使其磷酸化,继而激活mitogen activated protein kinase(MAPK)、phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)和phospholipase Cγ(PLC-γ)等一系列胞内信号转导通路,才能最终发挥其生物学功能。但是目前BDNF分泌的机制仍不明确。因此,研究BDNF分泌在学习记忆中的作用,寻找缺血性脑卒中后BDNF分泌的调控分子,明确其在缺血性脑卒中记忆障碍中的作用机制,将有助于进一步了解学习记忆的分子生物学机制,并有望成为缺血性脑卒中记忆障碍的重要治疗手段。综上所述,本课题采用CTA动物行为学和大鼠大脑中动脉线栓模型,应用Elisa、western-blot、实时荧光定量PCR、原位杂交、腺相关病毒、水迷宫等方法,系统的研究了 BDNF分泌在CTA记忆消退以及缺血性脑卒中后学习记忆障碍中的作用及其机制。通过本项研究,能够使我们进一步了解BDNF参与学习记忆的神经生物学机制,更为将来以BDNF及其调控分子为目标的缺血性脑卒中记忆障碍的诊疗提供新思路和新方法。研究目的:1.探讨岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。研究方法:1.脑内埋管将麻醉后的雄性Wistar大鼠头部固定于脑立体定位仪,以前囟点为原点,参考大鼠脑立体定位图谱,双侧脑内埋管至岛叶上lmm,术后一周开始后续实验。CTA消退测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF中和抗体,连续注射三天,观察动物行为学的变化。2.条件性味觉厌恶CTA记忆消退大鼠限水24小时后,每天上午定时喂水,适应3天,大鼠便会形成固定时间饮水的习惯。第4天,给予大鼠等量糖水,饮后40分钟腹腔注射氯化锂(LiCl),造成动物腹部不适,从而建立条件反射。3天后开始进行消退测试,测试时同时给予大鼠糖水和自来水,但不给予腹腔注射LiCl,分别记录动物饮自来水和糖水的量,计算饮自来水占饮液体总量的百分比,该比值称为厌恶指数。连续测试4天,随着测试天数的增加,厌恶指数逐渐降低,说明动物经过训练后记忆逐渐消退。3.缺血性脑卒中模型的建立雄性大鼠麻醉后,于颈部正中切口,逐层分离并暴露颈部血管,从颈外动脉或颈总动脉分叉部插入线栓,进入颈内动脉,阻断左侧大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)起始段及其所有血液供应,导致MCA局灶性缺血,缝合皮肤,留一线端在外,2小时后小心抽出线栓。假手术组只钝性分离颈总动脉,然后逐层缝合。4.实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)在CTA记忆消退和缺血性脑卒中术后,选定不同的时间点,取大鼠岛叶或海马,用RNA提取试剂盒提取RNA。取定量总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。最后根据目的基因的不同,选择不同的退火温度做实时定量PCR,检测目的基因的变化情况。5.BDNF Elisa在CTA记忆消退和缺血性脑卒中后特定时间点,取大鼠特定脑组织,提取蛋白后测定蛋白浓度。将标准品倍比稀释。取出板条,依次向每孔中加入分析液,标准品和待测样本,样本和标准品设置复孔,室温避光孵育2小时。振荡洗后,孵育二抗。再次洗涤后,加入底物工作液孵育显色,最后终止反应。6.原位杂交CTA消退第2天测试完毕后,在特定的时间点将大鼠麻醉后进行心脏灌流,取出脑组织后固定过夜后,置于蔗糖中沉淀直至沉至管底,冰冻切片机进行切片,切片厚度为40μm,每只动物留取6套组织切片进行原位杂交实验检测BDNFmRNA,最后用Image J软件统计各组岛叶的灰度值。7.免疫沉淀CTA记忆消退第二天测试完毕后不同时间点,于冰上取岛叶并用蛋白裂解液提取蛋白。取定量蛋白裂解液,向其中加入蛋白A微球润洗后,加入TrkB抗体,于4℃孵育3-4小时,向其中加入蛋白A微球,4℃孵育过夜,收集微球,经蛋白变性、电泳、转膜等步骤将蛋白转至PVDF膜,PVDF膜封闭结束后,分别孵育pY99磷酸化酪氨酸抗体及TrkB抗体检测磷酸化TrkB及总TrkB,根据两者的比值判断各组磷酸化TrkB的变化。8.Western blotCTA消退第二天测试完毕后或MCAO术后第一天及第三天取脑,加入蛋白裂解液研磨后提取蛋白,加上样缓冲液煮沸后将蛋白变性。经电泳、转膜及封闭后,分别加入 c-Fos、Erk、磷酸化 Erk、caspase-3、CAPS1、LC3B、TrkB、磷酸化TrkB、Akt及磷酸化Akt等抗体,4℃孵育过夜,回收一抗后,加入相应二抗室温孵育1小时,最后ECL显影。9.免疫组化缺血性脑卒中术后第一天及第三天,将大鼠麻醉,灌流取脑,冰冻切片机切片,切片厚度为20 μm,进行免疫荧光染色。切片经5%山羊血清封闭1小时后,滴加CAPS1及secretogranin I(突触致密囊泡DCV的蛋白标志物)的一抗,4℃孵育过夜,回收一抗后,滴加荧光二抗。最后用DAPI孵育5分钟,显微镜下观察CAPS 1与DCV共定位的情况。l0.Morris水迷宫水迷宫实验是测试缺血性脑卒中后学习记忆的常用实验。大鼠脑卒中术后恢复一周,第8天开始进行水迷宫实验。摄像机记录大鼠运动轨迹。定位航行实验:将大鼠依次从四个象限放入水中,记录大鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间,即逃避潜伏期,时间越短说明学习记忆能力越强,连续训练5天。空间探索实验:第13天撤去平台,记录大鼠60秒内在原平台象限的活动时间,以评判大鼠的空间记忆。结果:1.岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制1.1.岛叶BDNF参与CTA记忆消退过程为了明确岛叶中BDNF在记忆消退中的作用,我们选择在CTA消退第1、2、3天测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF抗体,用厌恶指数评价记忆消退的情况,厌恶指数越高消退越慢,说明大鼠学习能力越差;为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退能否诱导岛叶中神经元活化,我们用western blot检测了消退第二天测试完毕后90min岛叶中c-Fos的变化,结果显示:在岛叶中注射BDNF抗体后,从消退第二天开始,厌恶指数明显高于溶剂对照组,说明注射BDNF抗体能够阻断条件性味觉厌恶记忆消退过程;消退第二天测试完毕后90min,c-Fos表达量升高,说明岛叶中BDNF参与条件性味觉厌恶记忆消退过程,且条件性味觉厌恶记忆消退能够激活岛叶中神经元。为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退后岛叶中BDNF的变化,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取岛叶,分别用实时荧光定量PCR及BDNF Elisa检测了 BDNF mRNA及蛋白的变化情况。结果显示:CTA消退第二天岛叶中BDNF基因及蛋白表达量均出现不同程度的升高,而NGF和NT-4mRNA的表达水平没有明显变化,说明CTA消退特异性的诱导岛叶中BDNF出现时间特异性表达增加。另外,为了更直观的显示BDNFmRNA的变化,我们进一步用原位杂交验证了 Real-time PCR的结果。这些结果提示:CTA记忆消退诱导岛叶中BDNF表达升高,且BDNF的变化参与CTA记忆消退过程。1.2.CTA记忆消退诱导岛叶中活性依赖的BDNF分泌BDNF分泌释放后与TrkB受体结合并使其磷酸化,所以磷酸化TrkB的水平能够反映BDNF分泌的情况。为了进一步明确CTA消退能否诱导活性依赖的BDNF分泌,我们选择BDNF表达变化前以及BDNF升高的时间点,取岛叶脑组织,用免疫沉淀检测磷酸化TrkB,结果显示:在BDNF蛋白升高的时间点,岛叶中磷酸化TrkB水平升高,说明此时TrkB的磷酸化是由于BDNF蛋白合成后释放导致的。有趣的是,我们发现在BDNF升高前,磷酸化TrkB水平已经升高,说明在BDNF蛋白升高前,CTA记忆消退诱导了 BDNF分泌。为了进一步证实CTA消退诱导岛叶中BDNF分泌,我们用western blot检测了 BDNF下游分子Erk及其磷酸化情况,结果显示:与磷酸化TrkB变化一致,CTA消退第二天岛叶中磷酸化Erk升高,进一步证实BDNF分泌通过Erk信号通路参与CTA记忆消退过程。1.3.CTA记忆消退抑制神经元凋亡为了明确记忆消退过程中脑细胞凋亡的情况,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取脑,用western blot检测了凋亡相关分子caspase-3的变化,结果显示:CTA消退后caspase-3表达量降低,说明CTA记忆消退抑制岛叶中神经元的凋亡。文献报道,BDNF能够抑制神经元凋亡,因此我们的结果进一步提示岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。2.1缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加本课题采用大鼠左侧大脑中动脉阻塞线栓法制备缺血性脑卒中模型,术后1天,3天及7天取双侧海马,分别用Real-time PCR及Elisa检测BDNFmRNA及BDNF蛋白的变化,另外,用western blot检测BDNF受体p-TrkB及其下游分子p-Akt的变化情况。结果显示:与假手术组相比,双侧海马中BDNFmRNA及蛋白在术后1天及3天均出现了不同程度的升高,且在BDNF变化的时间点p-TrkB及p-Akt均出现了不同程度的升高,说明缺血性脑卒中诱导海马中BDNF分泌增加,且BDNF/TrkB/Akt信号通路可能在缺血性脑卒中预后中起着重要的调控作用。2.2缺血性脑卒中诱导海马CAPS1表达增加BDNF分泌是钙离子依赖的过程。体外研究表明,钙离子依赖分泌激活蛋白 1(Ca2+-dependent activator protein for secretion 1,CAPS1)在其中起着重要的调控作用。为了明确CAPS1是否参与调控缺血性脑卒中后BDNF分泌,我们在大鼠缺血性脑卒中术后BDNF升高的时间点取双侧海马,用western blot检测CAPS1的变化,结果显示:在BDNF及磷酸化TrkB升高的时间点,双侧海马中CAPS1表达升高,说明海马中CAPS1可能参与调控缺血性脑卒中后BDNF的分泌。2.3缺血性脑卒中后海马中CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌合成的BDNF储存于突触致密囊泡DCV中,为了进一步明确CAPS1调控BDNF分泌的机制,我们用免疫组化检测了缺血性脑卒中术后第1天及第3天海马中CAPS1与DCV共定位的情况。结果显示:与假手术组相比,脑卒中术后第1天及第3天,海马CAPS1与DCV共定位增强,提示CAPS1通过与DCV结合进而调控BDNF分泌。2.4海马CAPS1调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆障碍的恢复为了明确CAPS1是否通过调控BDNF分泌,进而参与缺血性脑卒中记忆障碍的调控,我们设计了 CAPS1腺相关病毒,大鼠海马内微量注射腺相关病毒1个月后建立缺血性脑卒中(MCAO)模型,MCAO术后恢复一周,术后第8天开始用水迷宫检测CAPS1在缺血性脑卒中记忆障碍的作用。我们首先用western blot检测了 CAPS1腺相关病毒对CAPS1及p-TrkB的影响,结果显示:与假手术组相比,注射病毒空载体(对照腺相关病毒)组在MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB表达显著升高,说明注射对照腺相关病毒对CAPS1的表达没有影响。与注射对照腺相关病毒相比,注射CAPS1腺相关病毒导致MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB的表达降低,且与假手术组没有差异,说明CAPS1腺相关病毒能够抑制缺血性脑卒中诱导的CAPS1表达及BDNF分泌。进一步应用水迷宫实验证实,缺血性脑卒中大鼠逃避潜伏期延长,说明空间学习记忆受损,但随着训练次数的增加,脑卒中大鼠的学习记忆能力逐渐恢复至正常水平;而海马内注射CAPS1腺相关病毒的脑卒中大鼠,记忆损伤不能恢复。这些结果表明,海马CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中后学习记忆损伤的恢复。结论:1.CTA记忆消退特异性诱导岛叶BDNF分泌及表达增加,且岛叶BDNF分泌参与CTA消退过程。2.岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。3.缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加,分泌的BDNF通过与其受体TrkB结合进而激活下游Akt信号通路。4.缺血性脑卒中诱导海马中CAPS1表达增加,且CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌。5.CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆损伤的恢复。意义:本课题研究了 BDNF分泌在记忆消退中的作用及其机制,并首次证实缺血性脑卒中能够诱导海马中BDNF分泌增加,且CAPS 1能够通过调控BDNF分泌参与脑卒中记忆损伤恢复的调控。这将使我们进一步明确BDNF及其调控分子在记忆相关疾病中的作用;并为缺血性脑卒中后认知功能障碍的治疗提供新的思路和新靶点。