子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠20周以后出现新发型高血压、蛋白尿以及其它全身系统性紊乱的妊娠期高血压疾病。子痫前期是引起母婴死亡率升高的主要原因之一,也是导致胎儿低出生体重、早产和死产的主要原因。国内外学者对子痫前期已有大量的研究,但其发病机制复杂,至今仍未完全阐明。胎盘是母体与胎儿直接接触的重要器官,胎盘作为母体和胎儿的共同体,对维持宫内胎儿的生长发育以及妊娠结局至关重要。分娩或胎盘摘除后子痫前期的临床症状迅速消失,表明胎盘因素在子痫前期的发病中发挥重要作用。表观遗传学在胎盘的发育中具有重要作用。近些年大量研究发现,子痫前期胎盘组织的表达谱较正常对照组有明显改变,提示表观遗传学在子痫前期的发展中具有重要作用。而孕周、子宫内环境、胎儿性别等都可以影响胎盘组织的基因组甲基化水平,已有研究发现,不同孕周的胎盘组织具有不同的DNA甲基化谱。目的本研究采用 Illumina Infinium HumanMethylation 850KBeadchip 平台分别对子痫前期、早产和正常足月妊娠胎盘组织的DNA进行全基因组甲基化谱分析。通过数据分析,筛选出可能与子痫前期相关的差异甲基化基因进行验证,并使用功能富集分析相关的信号通路,讨论这些基因甲基化水平的改变是否与子痫前期的发病机制有关。为子痫前期的发病机制提供新的依据。材料与方法1研究对象选取早发型子痫前期(Preeclampsia,PE)组、早产(Preterm birth,PB)组和正常足月妊娠(Term birth,TB)组的胎盘母体面组织各24例,PE组选取孕周<34周的早发型重度子痫前期;PB组选取妊娠28-37周,因胎膜早破、前置胎盘、宫颈功能不全等非特异性疾病导致的早产,两组的孕周相匹配;TB组选取妊娠37周或37周以后分娩,无并发症。2实验方法2.1胎盘组织标本的采集胎盘组织在剖宫产后15分钟内收集。在母体面表层5mm 下收集胎盘绒毛组织(大小约5×5×5mm、60mg),用预冷的PBS清洗胎盘组织,去除母体和胎儿的血液,保存于冻存管中。在采集标本时避开肉眼可见的坏死、梗死或钙化灶。提取RNA的胎盘组织置于RNA保存液中。采集的胎盘组织先在液氮中快速冷冻10分钟,然后置于-80℃冰箱保存备用。2.2 基因组 DNA 的提取和 Infinium HumanMethylation 850K Beadchip全基因组检测从胎盘组织中提取基因组DNA,提取后的DNA使用NanoDrop 2000和琼脂糖凝胶进行质检,质检合格后的DNA样本进行重亚硫酸盐转化,再进行Infinium HumanMethylation 850K Beadchip 全基因检测。2.3 Infinium HumanMethylation 850K Beadchip 数据分析2.3.1原始数据预处理原始数据(idat文件)经过过滤后,依据Peak Based Correction(PBC)算法对原始数据进行标准化。采用标准化的β值作为衡量该位点甲基化程度的指标,做样本分组之间的差异甲基化比较。2.3.2 差异甲基化位点(Differential methylated sites,DMSs)的分析DMSs的筛选是利用R语言的t-test(配对t检验)计算差异甲基化位点的P值,再采用Benjamini&Hochberg方法进行多重检验,输出adjusted P 值。根据adjusted P 值和delta β值(adjustedP<0.05且|Δβ|>0.10)筛选出差异甲基化探针位点。2.3.3 差异甲基化区域(Differential methylated regions,DMRs)的分析在基因组中差异甲基化位点经常会成簇出现,形成一段差异甲基化区域。DMRs代表着某个染色体区段整体的去甲基化或超甲基化,区段的范围小至数百bp,大到Mb级别。DMRs的筛选是使用ChAMP包,采用Probe Lasso方法。2.3.4功能富集分析功能富集分析是针对全基因和差异甲基化基因进行GO(Gene Ontology)功能和KEGG数据库中Pathway注释和归类。分别采用这两种方法对DMSs最邻近基因和DMRs中的基因进行功能富集分析。2.4焦磷酸测序选取差异甲基化基因(CMIP、BLCAP、MICA基因)的区域进行评估,设计焦磷酸测序引物,反向引物的5’末端采用生物素标记。对重亚硫酸盐转化后的DNA进行检测,验证差异甲基化基因的甲基化水平。2.5 RNA的提取和荧光定量PCR提取胎盘组织RNA,使用逆转录试剂盒将提取后的RNA逆转录为cDNA;设计引物,并使用荧光定量试剂盒分别检测CMIP、BLCAP、MICA基因的mRNA表达水平。3统计学分析使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7.0进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以(?)表示,两组数据之间的相关性分析采用Student’s-t相关系数分析,组间显著性差异采用单因素方差分析(ANOVA)。Infinium HumanMethylation 850K Beadchip结果中代表甲基化程度的β值采用非参数统计方法Mann-Whitney检验。以α=0.05为检验水准。结果1研究对象的临床特征PE组和PB组的孕周显著低于TB组(P<0.01),而PE和PB两组孕周的差异无统计学意义(P>0.05)。PE组的血压和尿蛋白均显著高于TB组和PB组(P<0.01)。PE和PB组新生儿出生体重显著低于TB组(P<0.001),而且与PB组相比,PE组的新生儿出生体重也显著降低(P<0.001)。母亲年龄和胎儿性别在三组之间的差异无统计学意义。2三组胎盘组织的DNA甲基化水平PE和PB组胎盘组织的整体甲基化水平均显著高于TB组,提示胎盘组织的甲基化水平可能与孕周密切相关。排除孕周的影响,PE组有808个差异甲基化位点,其中524个低甲基化,284个高甲基化。有137个差异甲基化基因,将这些差异甲基化位点定位于染色体上并注释,其中差异最显著的为CMIP基因、BLCAP基因和MICA基因。3差异甲基化基因的验证将850K芯片筛选出的差异甲基化基因(CMIP基因、BLCAP基因和MICA基因)进行焦磷酸测序验证,并检测基因的mRNA表达水平。经焦磷酸测序验证,CMIP基因和BLCAP基因在PE中为低甲基化,而mRNA的表达水平均升高。而MICA基因的甲基化水平和mRNA表达水平在三组之间的差异均无统计学意义。4功能富集分析使用DAVID 6.7对差异甲基化基因进行GO和KEGG pathway富集分析。差异甲基化基因主要在生物学功能、细胞成分、分子功能三个功能亚类显著富集,主要包括:细胞粘附、神经系统的发育、生物学附着、系统的发育、多细胞器官的发育等。其中共有232个差异甲基化基因参与细胞的黏附功能,是富集最显著的生物学过程。显著富集的信号通路包括:丙酮酸代谢、甘油脂类代谢、磷脂酶D信号通路、PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、ECM-受体相互作用等。其中PI3K-Akt信号通路是差异甲基化基因富集最多的信号通路。其他显著富集的通路还包括cAMP、Wnt和MAPK信号通路等。结论胎盘组织的甲基化水平与孕周密切相关,子痫前期胎盘组织的整体甲基化水平降低。对胎盘组织DNA甲基化组学的研究可能对研究发病机制提供支持和方向。