静电纺丝技术可广泛应用于制备基于不同种类的合成聚合物、天然聚合物、或者它们的复合物的纳米/微米纤维支架。通过静电纺丝技术制备的支架可以仿生天然细胞外基质(ECM)的纤维结构,尤其是能够模拟ECM的尺寸(50-500 nm)。因此,通过静电纺丝技术制备的基于纳米纤维的支架在组织工程中有重要的应用。多种改进的静电纺丝技术已制备不同拓扑结构的组织工程支架。例如,通过动态水流静电纺丝设备、双向共轭静电纺丝设备以及已经商业化的纺纱设备可制备纳米纤维纱线,其具有比纳米纤维更大的孔径和孔隙率,以及很好的取向性,可用于调控细胞的生长形貌、表型、迁移和渗透行为。然而,仅由组织工程支架提供拓扑结构信号有时并不足以及时的调控细胞生长和促进组织再生,这时需要对组织工程支架进行生物功能化,以得到结构和生物功能都仿生的组织工程支架,更好的调控细胞的生长行为以及促进组织再生。组织工程支架生物功能化的方法主要包括:通过化学修饰或物理吸附将生物信号负载到支架表面,以及制备壳芯结构纳米纤维将生物信号负载到纤维内部。此外,生物功能信号在组织工程支架上的分布可以是均一的或具有梯度的,以提供均匀的或者趋化的生物信号。因此,基于静电纺纳米纤维支架的结构调控和生物功能化的不同方法,本文研发了四种具有不同拓扑结构和生物功能的支架,并研究了各支架在不同软组织再生中的应用潜力。具体的研究内容与结果可以概括为以下四部分:(1)为了制备一种能够模拟天然神经组织的神经纤维束结构、同时具有生物功能性的神经导管,本课题中通过使用传统的静电纺丝技术与商业化的纺纱设备,设计并制备了具有层粘连蛋白涂层的、内腔填充了纳米纤维纱线的(LC-YE-PLGA)神经导管。拉伸力学和接触角测试结果表明,层粘连蛋白涂层提高了PLGA纳米纤维和纳米纤维纱线的拉伸力学强度和杨氏模量,增强了亲水性。体外生物学评价结果表明,比起致密的PLGA纳米纤维,PLGA纳米纤维纱线的三维结构能够更有效的促进雪旺细胞(SCs)的增殖,而通过层粘连蛋白涂层后,SCs的增殖得到进一步增强。对神经导管进行压缩力学测试结果表明,LC-YE-PLGA神经导管在沿着神经导管的径向和长轴方向都具有良好的抗压缩性能,满足外周神经组织工程的需求。在LC-YEPLGA神经导管的一端种植SCs,研究SCs在神经导管中的增殖和迁移,结果表明,在LC-YE-PLGA神经导管中,SCs绕着神经导管内部的每一根纱线生长,通过神经导管横截面的H&E染色和免疫荧光染色可以观察到与天然神经纤维束类似的结构。此外,沿着神经导管的长轴方向,由于涂层的层粘连蛋白提供了生物信号,通过神经导管纵切面的H&E染色和免疫荧光染色图片观察到SCs能够沿着内腔中平行排列的纳米纤维纱线迁移。以上结果表明,将神经导管内部填充的纳米纤维纱线提供的结构信号与层粘连蛋白涂层提供的生物信号相结合,可以使该种神经导管在外周神经组织再生中有很好的应用潜力,也为设计新一代神经导管提供了研究基础。(2)为了将向心取向纳米纤维提供的拓扑结构信号与活性蛋白提供的生物信号相结合,研发一种通用的、可产生由外周向中心或由中心向外周梯度增加的生物活性蛋白涂层的方法,本课题中首先制备了具有向心取向结构的聚己内酯(PCL)纳米纤维,然后在该纳米纤维上通过蛋白吸附作用进行生物功能化。通过用铜丝将支架的中心点顶起,正置或倒置放入容器中,逐滴加入牛血清白蛋白(BSA)溶液,使得支架上沿着纤维取向方向先涂层一层梯度的BSA蛋白,然后将支架放平,将目标生物活性蛋白吸附于支架上BSA蛋白空出的位置,以产生与BSA蛋白方向相反的活性蛋白梯度。首先通过用异硫氰酸荧光素标记的BSA(FITC-BSA)作为上述目标生物活性蛋白的模型,分别在向心取向PCL纳米纤维上制备由外周向中心或由中心向外周梯度增加的FITC-BSA涂层,通过荧光显微镜检测纳米纤维膜上不同区域的荧光强度,证明了通过该方法可以在PCL向心取向纳米纤维膜上产生上述的两种不同方向的蛋白梯度。为了阐述使用该方法制备的具有梯度的生物活性蛋白涂层的、向心取向的纳米纤维膜在组织工程中的潜在应用,本研究中分别在向心取向PCL纳米纤维上制备了由外周向中心梯度增加的层粘连蛋白涂层或表皮生长因子(EGF)涂层、由中心向外周梯度增加的神经生长因子(NGF)涂层,分别研究由外周向中心梯度增加的层粘连蛋白涂层或EGF涂层对成纤维细胞(NIH-3T3)或角细胞从纳米纤维膜的外周向中心迁移的影响、以及由中心向外周梯度增加的神经生长因子(NGF)涂层对背根神经节(DRG)轴突伸展的影响。对细胞核和细胞骨架的荧光染色结果表明,向心取向PCL纳米纤维能够促进NIH-3T3和角细胞沿着纤维取向方向迁移,而分别涂层了由外周向中心梯度增加的层粘连蛋白和EGF之后,NIH-3T3和角细胞沿着纤维取向方向的迁移得到显著提高,通过计算不同迁移区域的细胞迁移数目和迁移指数(MI),发现NIH-3T3或角细胞在具有梯度的层粘连蛋白涂层或EGF涂层的向心取向PCL纳米纤维膜上的细胞迁移数目和MI都要比在具有均一蛋白涂层以及不具有蛋白涂层的向心取向PCL纳米纤维膜上显著增高。以DRG作为神经轴突延伸评价的模型,免疫荧光染色结果表明,在具有由中心向外周梯度增加的NGF梯度的向心取向PCL纳米纤维膜上,DRG细胞的轴突沿着PCL纤维取向方向延伸,并且轴突朝着NGF含量高的方向(外周方向)延伸的长度是轴突朝着NGF含量低的方向(中心方向)延伸长度的1.44倍,表明这种支架具有模拟视神经轴突延伸方向(从中心向外周)的潜力。因此,本研究不仅提供了一种在向心取向的纳米纤维膜上产生梯度的生物活性蛋白的新方法,更为促进大面积的皮肤伤口快速愈合以及神经轴突延伸提供了具有拓扑结构信号以及生物功能化的新型纳米纤维支架,同时也为其他需要细胞迁移和神经轴突延伸的组织再生应用提供了新的可能。(3)为了仿生天然血管的多层结构以及不同层的功能,包括血管内腔的抗凝、快速内皮化以及中层平滑肌的渗透生长,本研究中设计并制备了一种双层血管支架,内层为生物功能化的PLCL/COLHEP/CD133纳米纤维,外层为疏松多孔的PLCL/COL纳米纤维纱线,研究其在血管组织工程中的应用潜力。通过SEM观察到血管支架的双层结构,拉伸力学测试结果表明,该双层血管支架具有与猪冠状动脉相匹敌的拉伸力学性能,并且其顺应性要好于商用e-PTFE支架,也与人隐静脉的顺应性相匹敌。双层血管支架的体外缓释结果表明,肝素和CD133抗体的释放可以达到40天,有助于维持血管内腔的通畅性、抑制血栓以及促进再内皮化。血小板粘附实验以及溶血实验的结果表明,PLCL/COL-HEP/CD133纳米纤维具有良好的血液相容性。体外生物评价结果表明,负载CD133抗体的纳米纤维上内皮祖细胞(EPCs)的粘附和增殖都得到了显著增强,并且通过荧光显微镜以及SEM观察到EPCs在PLCL/COL-HEP/CD133纳米纤维上生长时有很好的铺展以及细胞与细胞之间的相互作用,可见连续的细胞单层,表明PLCL/COL-HEP/CD133纳米纤维可以作为血管支架内层,促进血管内腔的通畅率和快速内皮化。外层的PLCL/COL纳米纤维纱线为疏松多孔的结构。体外生物评价结果表明,比起致密的纳米纤维,平滑肌细胞(SMCs)在纳米纤维纱线上的增殖更好,并且通过SEM观察到SMCs沿着纱线的方向生长,通过免疫荧光染色观察到SMCs可以完全渗透到纳米纤维纱线内部。进一步将双层血管支架移植到大鼠腹主动脉,2个月后将双层血管支架取出,通过H&E染色、Masson三色染色、CD31和α-SMA的免疫荧光染色表征组织再生。实验结果表明,该双层血管支架能够维持内腔的血流通畅性,促进快速的再内皮化。血管支架的外层也观察到平滑肌组织的渗透生长。再生的血管组织(内皮和平滑肌组织)成分与天然血管相同,结构也与天然血管相似,表明该双层血管支架在初期血管组织再生中有很好的效果。(4)在上一章课题的研究基础上,为了进一步提高血管支架的快速内皮化和平滑肌的圆周取向、三维渗透生长,本章中继续对血管支架内外层进行优化。设计并制备了一种双层血管支架,将PLCL/COL-HEP/VEGF纳米纤维作为血管支架内层,负载梯度PDGF的取向、多孔的PLCL/COL纳米纤维纱线作为血管支架外层。体外生物评价结果表明,在负载VEGF的纳米纤维上EPCs的增殖得到了显著增强。通过荧光显微镜以及SEM观察到EPCs在PLCL/COLHEP/VEGF纳米纤维上生长时有很好的铺展以及细胞与细胞之间的相互作用,可见连续的细胞单层。更进一步,将PLCL/COL-HEP/VEGF纳米纤维放入缓释培养基中孵育不同时间,再用缓释培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),发现该种纳米纤维缓释出的VEGF能够促进HUVECs的粘附和增殖,以及细胞之间的相互作用。此外,外层的负载三维梯度的血小板衍生生长因子(PDGF)、并且取向多孔的PLCL/COL纳米纤维纱线上SMCs的增殖和取向性得到显著增强。H&E染色结果表明,SMCs在PLCL/COL纳米纤维纱线上生长4天后,有向支架内部渗透的趋势,负载PDGF进行生物功能化之后,SMCs的渗透生长得到增强。进一步对双层血管支架进行拉伸力学测试,结果表明该双层血管支架具有与猪冠状动脉相匹敌的拉伸力学性能,以及与人隐静脉相匹敌的顺应性。体外缓释结果表明,肝素、VEGF和PDGF的释放可以达到40天以上。将双层血管支架在大鼠腹主动脉中移植2个月后,通过H&E染色和Masson三色染色观察到血管支架中层的肌纤维生成和外层的胶原蛋白生成。通过CD31和α-SMA的免疫荧光染色结果表明,血管支架内层有连续的、单层的内皮组织形成,血管支架外层有取向的平滑肌组织再生,并且平滑肌组织能够更好的渗透到支架内部。再生的组织仿生了天然血管组织的结构和成分,表明该双层血管支架在初期血管组织再生中有更好的效果。综上所述,本论文中采用不同的静电纺丝方法,制备了四种基于纳米纤维和/或纳米纤维纱线的组织工程支架,然后对不同的支架有选择的进行生物功能化,包括:通过化学修饰或物理吸附将均一的或者梯度的生物因子涂层到支架表面;通过同轴静电纺丝技术将均一的或者梯度的生物因子负载到纤维内部。根据四种支架不同的拓扑结构以及生物功能,分别研究了它们在外周神经修复、伤口愈合、血管组织再生中的应用前景。