高血压是一种高发病率、多并发症的危险疾病。降血压肽是一类能有效降低人体血压的多肽的总称，可通过抑制人体血管紧张素II的生成而达到降低血压的目的。它具有降压效果明显、毒副作用低、来源广泛等优点，已成为研究的热点。目前，降血压肽的制备研究主要采用酶解法，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题，还未实现大规模产业化。利用基因工程技术生产降血压肽，便于进行大规模生产，发展前景广阔。为解决本实验室以前构建的降血压肽基因工程菌pGEX-4T-2-AHP多肽产量低、分离纯化成本高等问题，本课题重新设计并成功构建出具有良好降血压活性的串联降血压肽大肠杆菌表达系统，探讨串联个数对目的蛋白表达量的影响，并对其发酵条件进行优化。主要研究内容和结果如下：　　 根据文献及本实验室对降血压多肽的研究选择了多肽片段VLPVPK，测定其体外ACE酶抑制活性IC50为4.2μmol/L。动物实验表明给药剂量为800μg/kg(体重)和400μg/kg(体重)时，此多肽对高血压大鼠( SHR)具有极显著降压效果(P<0.01)，2h后降压幅度分别达39.9±15.4mmHg.35.6±17.OmmHg:给药剂量为200μg/kg(体重)时，降血压效果无显著性；以400μg/kg(体重)给药2h后血压降至最低点，此后有所回升4h后趋于稳定，降血压效果仍具有显著性，药效可持续24h以上，36h后，血压基本恢复到给药前水平。而此多肽对血压正常大鼠( WKY)无显著的降血压作用。　　 体内外活性实验表明此多肽具有良好的降血压活性，选择此较理想的多肽片段做为重组降血压肽序列。将此六肽分别连接成6、8、10拷贝的串联多肽，根据大肠杆菌偏爱密码子合成重组降血压肽基因序列，克隆至原核表达载体pET-15b，并转入E.coli BL21(DE3)，诱导后SDS-PAGE电泳检测，融合表达产物主要以可溶形式存在，且随串联个数的增多存在于包涵体中的融合蛋白也增多。通过HPLC鉴定，表明表达出来的融合蛋白中确实存在目的多肽。6串、8串、10串重组菌中目的多肽VLPVPK浓度分别为：94mg/L、117 mg/L、138 mg/L。　　 重组质粒pET-15b-AHP-6、8、10在宿主菌Ecoli BL21中具有很好的分离稳定性和结构稳定性。采用正交设计实验优化了培养基和发酵工艺。随着串联个数的增加，工程菌生长所需的碳氮源及无机离子的量均有所增加。优化结果为6串联多肽工程菌培养基的最佳配方为：Tryptone2％、Yeast Extract2％、NaCl0.5％、Glycerol0.5％、Glucose0.5％、KCl2mmol/L；8串工程菌培养基的最佳配方为：Tryptone2.5％、Yeast Extract2％、NaCl0.5％、Glycerol1.0％、Glucose0.5％、KC14mmol/L、 CaCl22 mmol/L；10串工程菌培养基的最佳配方为：Tryptone2.5％、Yeast Extract2％、NaCl0.5％、Glycerol1.0％、Glucose0.5％、KCl4mmol/L、CaCl24mmol/L。培养条件和诱导条件优化结果为：培养温度30℃、pH7.0、装液量20％(v/v)、接种量5％(v/v)；表达可溶性目的蛋白的最佳培养条件为：诱导温度30℃、诱导起始OD600值1.5、IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导时间4h；表达包涵体目的蛋白的最佳条件为：诱导温度44℃、诱导起始OD600值0.5、IPTG浓度为1.5mmol/L、诱导时间8h。用乳糖代替IPTG诱导目的蛋白表达的最佳诱导条件为：诱导温度37℃、诱导起始OD600为1.5、诱导时乳糖添加量为15 g/L，诱导时间为8h。经优化后融合蛋白产量大大提高：6串联肽1.85g/L，8串联肽2.18g/L，10串联肽2.62g/L，是未优化前的十倍左右，且用乳糖代替IPTG对融合蛋白的表达量没有太大的影响。