【摘 要】
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目的:研究NK92细胞在白细胞介素15（Interleukin 15,IL-15）基因修饰和低氧条件处理后外泌体的产量,阐明高表达IL-15基因修饰及低氧条件处理在NK92细胞产生外泌体中的抗肿瘤作用机制,为深入理解NK92细胞外泌体在肿瘤的过继免疫治疗中的作用提供新的研究思路和视角。方法:（1）采用稳定高表达IL-15的NK92（HIL-15 NK92）细胞和NK92细胞分别通过FCM和West
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目的:研究NK92细胞在白细胞介素15（Interleukin 15,IL-15）基因修饰和低氧条件处理后外泌体的产量,阐明高表达IL-15基因修饰及低氧条件处理在NK92细胞产生外泌体中的抗肿瘤作用机制,为深入理解NK92细胞外泌体在肿瘤的过继免疫治疗中的作用提供新的研究思路和视角。方法:（1）采用稳定高表达IL-15的NK92（HIL-15 NK92）细胞和NK92细胞分别通过FCM和Western blot鉴定GFP荧光和IL-15蛋白在HIL-15 NK92细胞上的表达情况。（2）采用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测HIL-15 NK92细胞的增殖活性和细胞毒性。（3）分别收集HIL-15 NK92细胞培养上清和常氧以及低氧条件下的NK92细胞培养上清,采用超高速梯度离心的方法提取外泌体,并采用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）、纳米粒子追踪技术（Nanoparticle-tracking analysis,NTA）和 Western blot 的方法对提取的外泌体进行形态、大小和标记蛋白的鉴定。（4）采用实时细胞分析仪（Real-time cell analysis,RTCA）、细胞划痕实验和Annexin V凋亡试剂盒检测了 HIL-15 NK92细胞外泌体、常氧和低氧NK92细胞外泌体对靶细胞MCF-7和A2780细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。（5）Western blot检测HIL-15 NK92细胞外泌体、常氧和低氧NK92细胞外泌体中FasL、穿孔素和颗粒酶B蛋白的表达差异。结果:（1）HIL-15 NK92细胞中GFP荧光表达率为97.85%,经Western blot鉴定,HIL-15 NK92细胞高表达IL-15蛋白。（2）高表达IL-15基因修饰能提高NK92细胞的增殖能力（P＜0.001）,提高了对白血病K562细胞、实体瘤乳腺癌MCF-7细胞和卵巢癌A2780细胞的杀伤能力（均P＜0.05）。（3）经TEM、NTA和Western blot鉴定,HIL-15 NK92细胞外泌体、常氧和低氧NK92细胞外泌体成功获得。（4）低氧处理能提高NK92细胞外泌体的产量（P＜0.001）,并且HIL-15 NK92细胞外泌体和低氧NK92细胞外泌体均能提高抑制肿瘤细胞的增殖（P＜0.05;P＜0.05）、迁移（P＜0.01;P＜0.05）,和促进肿瘤细胞的凋亡能力（P＜0.05;P＜0.05）。（5）Western blot结果显示,高表达IL-15基因修饰和低氧处理均能提高NK92细胞外泌体中FasL、穿孔素和颗粒酶B蛋白的表达（P＜0.05;P＜0.05）。结论:（1）高表达IL-15基因修饰增强了 NK92细胞增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤能力。（2）低氧处理提高了 NK92细胞外泌体的产量,并且HIL-15 NK92和低氧NK92细胞外泌体抑制肿瘤细胞增殖和迁移,促进肿瘤细胞凋亡的能力显著增强。（3）高表达IL-15基因修饰和低氧处理后获得的外泌体影响肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡等功能,与外泌体中FasL、穿孔素和颗粒酶B蛋白的表达上调有关。
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