豆科模式植物百脉根（Lotus japonicus）是一种碳水化合物丰富和饲用价值高的优质牧草,还具有改良土壤结构、提升土壤肥力和水土保湿等多种功能,在我国国民经济中占据非常重要的地位,深入研究百脉根发育和环境适应性机制对提升和发挥它的潜能具有重要意义。miRNAs（micro RNAs）是一类长度为20-24nt的内源性非编码单链小分子RNAs,通过碱基序列互补配对的方式与靶基因结合后在转录后或翻译水平负调控靶基因的表达,是动植物体内重要的调控分子。在植物中miRNAs参与生长发育、新陈代谢和响应逆境胁迫等多个生理活动过程。百脉根中含有大量的miRNAs,但是目前对百脉根中miRNAs的深入研究仍然十分缺乏,因此在前人的基础上,从miRNA分子的角度对百脉根进行更深一步的研究和应用还有很大的前景。短串联靶标模拟技术（Short Tandem Target Mimic,STTM）是一种特异性强和高效沉默miRNAs的技术,尽管STTM技术已被广泛应用于拟南芥及水稻等模式植物和农作物中,但在豆科模式植物百脉根中是否可行仍然未知。因此本工作主要聚焦百脉根中相关miRNAs的分析和探究STTM技术在百脉根中是否高效可行,从而为进一步研究百脉根中miRNAs的生物学功能奠定基础。本文首先利用小分子RNAs高通量测序分析了百脉根营养顶端分生组织（Shoot apical meristem,SAM）和复叶中的miRNAs,结果发现高度保守的miR166、miR167、miR168和miR396在百脉根营养顶端分生组织和复叶中大量富集,而在百脉根中特异的miRNAs如miR7516和miR11115等也在营养顶端分生组织和复叶中大量表达。通过将百脉根营养顶端分生组织和复叶中大量表达的miRNAs进行对比分析发现,miR11148较为特异的在复叶中表达,而miR11097b、miR11122和miR11137在营养顶端分生组织中特异性表达。另外,百脉根环境适应性较好,但耐寒性较差,为此我们也通过小分子RNAs高通量测序对百脉根中响应低温胁迫的miRNAs进行了寻找。结果发现miR398、miR11173和miR11078c在低温胁迫处理后表达量大幅度上调,其中miR398分子序列高度保守,而部分miRNAs如miR11093和miR11131等表达量明显下调。为了进一步研究保守miRNAs在百脉根中的功能,我们利用STTM技术对保守的miR166、miR396和miR398进行了敲除。为了获得稳定遗传的miRNAs敲除突变体,我们优化了百脉根植物组织培养转化体系,通过调整组织培养转化体系中的植物激素浓度与培养周期,提高了诱导效率和加快了培养速度。用优化后的植物组织培养转化体系将miRNAs敲除质粒转化百脉根,成功获得了Lj STTM166、Lj STTM396和Lj STTM398敲除的百脉根转基因材料。进一步分析发现,和野生型相比,转基因材料中miR166、miR396和miR398的表达量明显降低,同时它们对应靶基因的表达量显著表达上调,说明STTM技术在百脉根中高效可行。综上所述,本文用小分子RNAs高通量测序对百脉根中参与生长发育和低温胁迫响应的miRNAs进行了分析,在优化了百脉根组织培养转化体系的基础上通过STTM技术对部分保守miRNAs进行了敲除,证明了优化百脉根植物组织培养转化体系的稳定性和STTM技术在百脉根中沉默miRNAs的高效性。为后续深入展开百脉根复叶生长发育和抗寒性研究奠定了基础。