研究背景据国家卫生部公布的《全国第三次死因调查》报告,肺癌已替代肝癌成为我国恶性肿瘤死亡原因第一位(约占全部恶性肿瘤致死的22.7%)。在全球,肺癌的发病率和死亡率也是居各种癌症之首,根据第38届美国临床肿瘤学会年会报告的统计数据,肺癌每年约造成全球140万人死亡,并且呈逐年上升态势。肺癌早期多无明显症状,尤其是占肺癌80%的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC),65%-80%的患者确诊时已属中晚期,有远处病灶转移,常失去外科手术和放疗机会。因此,在肺癌的治疗上,药物的作用显得尤为重要。遗憾的是,对于肺癌的药物治疗,目前仍缺乏持久有效的药物,即便是具有特异性强、毒性作用小等优势的新兴分子靶向治疗药物(如酪氨酸激酶信号传导通路抑制剂),也因其局限的适用指征,而并不适合多数肺癌患者。国际癌症组织推荐的以顺铂为基础的联合化疗作为NSCLC的一线标准化疗方案,并取得了一定的疗效。多项随机临床试验及荟萃分析显示,不同的含铂方案疗效近似,而目前还没有总体疗效优于含铂治疗方案。随着铂类药物的广泛应用,不可避免地会引起肿瘤细胞对其产生耐药性,使化疗效果明显降低[3]。研究显示,70-80%的患者化疗初期可暂时缓解病情,但长期应用时会对铂类药物产生抗性,导致复发率高达60%以上,而复发性肺癌的耐药性明显增加,化疗药物缓解率则不足30%,这已成为当前困扰肺癌治疗的一大难题。铂类药物是目前应用最广泛的化疗药,对肺癌、睾丸癌、卵巢癌、头颈部癌、肝癌、肠癌、乳腺癌等都是一线治疗用药,也常用于骨肉瘤及白血病的治疗。研究发现,肿瘤细胞对铂类药物耐药的形成与多药耐药蛋白(MRP)无关,尽管诸如铜离子受体、ATP7B、谷胱甘肽以及DNA的修复蛋白等许多因素被认为在铂的耐药形成中起一定作用,但至今并没有一个明确的机制,也正因为如此,目前并没有合适的靶点用于逆转细胞对铂的耐药性。然而癌细胞一旦对顺铂形成耐药,会对阿霉素、长春碱、氟尿嘧啶、VP-16、丝裂霉素等众多一线化疗药形成多药耐药,其危害尤为严重。因此,寻找特异的的铂类耐药相关的分子靶点而开发针对肺癌铂类耐药的逆转药物或疗法已成为肺癌临床治疗中亟待解决的难题,也是当前国内外研究的热点。近年来研究者发现,抑癌基因的表观遗传学沉默与肺癌及其耐药的发生发展关系密切。DNA甲基化转移酶抑制剂(DNA methyltransferases inhibitor, DNMTi)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors, HDACi)等药物可逆转由DNA甲基化及组蛋白去乙酰化所导致的化疗敏感基因下调,诱导其重新表达,进而恢复肿瘤细胞的顺铂敏感性。此类药物为肺癌耐药的临床治疗提供可能性,目前已开发出许多针对DNMTs或HDACs的抑制剂,且已进入临床评估阶段。然而,这种疗法能使全基因组发生DNA去甲基化及组蛋白高乙酰化,可导致基因组不稳定,进而增加发生广泛肿瘤及生长缺陷的危险性。同时,在恶性肿瘤中,有部分基因由于DNA低甲基化而呈高表达,进行DNA去甲基化治疗可增加肿瘤耐药及转移的可能性。因此,寻找更为特异性的逆转肿瘤耐药的表观遗传学作用靶点而提高化疗敏感性,具有重要意义。RBAP48(Retinoblastoma-associated protein48)属于多梳蛋白家族(Polycomb Group, PcG),是从许多涉及染色质集合、装配以及核小体修饰复合物中分离出的第一个被鉴定的高峰度蛋白。RBAP48作为核染色质重构和脱乙酰酶(NuRD)、组蛋白脱乙酰酶复合物Sin3、组蛋白去乙酰化酶复合物HDAC、Lin复合物、CAF-1复合物等ATP依赖的染色体重组复合物的组成成分,并且调节它们的功能,通过直接作用于Rb蛋白或参与PRC2介导的DNA甲基化、组蛋白甲基化、去乙酰化等表观遗传学调控,从而在细胞周期、细胞衰老、细胞增殖分化和基因印记等一系列染色质活动中发挥重要作用。国内外有学者发现RBAP48在宫颈癌、甲状腺癌、原发性肝癌、急性骨髓性粒细胞性白血病等恶性肿瘤中的表达均有改变,并与肿瘤的增殖等恶性生物学行为密切相关。有研究认为,RBAP48有望成为判断肿瘤复发及预后的有效指标之一。本课题组前期关于HDCAi逆转肺癌顺铂耐药性的机制研究中也发现,曲古菌素A联合顺铂可抑制耐药细胞株增殖活性并抑制RBAP48的表达。本研究设想,RBAP48可能与肺癌细胞的增殖及其顺铂耐药性的形成存在相关关系。然而,目前仍缺乏关于RBAP48在肺癌中的表达及其在细胞顺铂耐药中的作用的系统性研究。本研究计划正是基于以上设想而设计和开展的,首先拟以非小细胞肺癌细胞及其顺铂耐药株为主要研究对象,研究细胞中RBAP48基因的表达及其与顺铂耐药之间的关系,观察重组质粒及siRNA调节细胞中RBAP48的表达对细胞增殖及顺铂敏感性的影响。在此基础上,探究RBAP48调控肺癌细胞顺铂耐药的初步机制,为进一步分析RBAP48能否成为逆转肺癌顺铂耐药的分子靶点提供理论基础与实验依据。本研究按以下三部分进行。一、RBAP48基因在肺癌细胞中的表达及其与细胞顺铂耐药相关性的实验研究目的：比较RBAP48基因在人肺正常细胞、肺癌细胞及其顺铂耐药株中的表达差异,检测顺铂对肺癌细胞RBAP48表达的影响,以期探究RBAP48在肺癌细胞中的表达及其与细胞顺铂耐药的相关性。方法：1、以正常人支气管上皮细胞NHBE、16HBE、L132及非小细胞肺癌A549细胞及其顺铂耐药株A549/DDP为研究对象,利用Western blot检测RBAP48在肺癌细胞中的表达。2、运用梯度浓度的顺铂分别处理A549及A549/DDP细胞,通过MTT法检测两种细胞对顺铂敏感性的差异。3、A549/DDP细胞经不同剂量顺铂处理后,Western blot观察RBAP48的表达变化；进一步以低剂量顺铂长期连续诱导亲本株A549,Western blot比较经DDP刺激1、3、6个月的细胞与无DDP刺激的A549之间RBAP48蛋白的表达差异。结果：1、Western blot结果显示,RBAP48在顺铂耐药细胞株A549/DDP中的表达最高,其蛋白表达量分别是A549、NHBE、16HBE和L132的(66.67±28.87)、(4.95±2.38)、(6.39±2.10)和(2.18±0.28)倍,(P<0.01)。2、MTT结果发现,随着顺铂浓度的升高,两种细胞的抑制率均上升,肺癌细胞A549及其顺铂耐药株对顺铂的半数抑制浓度(IC50)分别为7.07±0.87μmol/L、38.10±4.33μmol/L,提示两种细胞对顺铂敏感性差别显著(P<0.01)。3、Western blot结果显示,经顺铂处理后A549/DDP细胞的RBAP48蛋白表达可呈剂量和时间依赖性升高；进一步检测经长期低剂量顺铂诱导的A549细胞中RBAP48表达变化的结果表明,RBAP48的表达量随着顺铂诱导时间及剂量的增加而显著上调。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：1、RBAP48在非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株中呈高表达。2、RBAP48的表达可能与细胞顺铂耐药性的形成存在一定的相关性。二、RBAP48基因表达对肺癌细胞增殖及顺铂耐药性影响的实验研究目的：调节肺癌细胞中RBAP48基因的表达,探究其表达对肺癌细胞增殖及顺铂耐药性影响。方法：以高表达RBAP48的A549/DDP细胞和低表达RBAP48的A549细胞为实验对象,分别应用RNA干扰技术设计靶向RBAP48-siRNA沉默RBAP48及重组DNA技术构建重组质粒RBAP48-pEGFP-N1过表达RBAP48,MTT法检测转染对肺癌细胞增殖及顺铂敏感性的影响；采用流式细胞术检测转染后细胞凋亡与周期变化；采用β半乳糖酐酶检测转染后细胞衰老情况的变化。结果：1、与未转染组及阴性对照转染组相比,RBAP48-siRNA转染组A549/DDP细胞的RBAP48蛋白表达量分别下降(4.16±1.82)、(4.48±2.25)倍,siRNA可显著下调RBAP48的表达；RBAP48-pEGFP-N1转染组A549细胞的RBAP48蛋白表达量分别升高(3.35±0.51)、(3.52±0.55)倍,重组质粒可显著上调RBAP48的表达(P<0.01)。2、以RBAP48-siRNA沉默549/DDP细胞RBAP48基因的表达,MTT结果显示,与未转染组相比,RBAP48-siRNA转染组细胞增殖显著受抑,对顺铂的IC50值由40.21±0.71μ mol/L下降至17.15±0.53μmol/L(P<0.05),耐药株细胞对顺铂敏感性显著增加；细胞凋亡实验结果表明,沉默RBAP48对细胞凋亡率无显著性改变,且在相同剂量的顺铂诱导下,RBAP48-siRNA组凋亡细胞比例的变化并无明显增加,提示调节RBAP48的表达对肺癌耐药细胞的凋亡率无显著影响(P>0.05)；细胞周期结果显示,与未转染组相比,RBAP48-siRNA转染组细胞G1期比例由56.47±0.94%升高至74.38±1.40%,并逆转了顺铂所致的S期比例升高,细胞出现G1期阻滞(P<0.05)；β-半乳糖酐酶实验结果表明,沉默RBAP48-siRNA可使耐药株细胞明显出现衰老现象,且与顺铂联用可显著加速对细胞的衰老诱导作用。2、以RBAP48-pEGFP-N1重组质粒上调A549细胞RBAP48基因表达,MTT结果显示,与未转染组相比,RBAP48-pEGFP-N1转染组细胞增殖能力增强,对顺铂的IC50由7.11±0.45μmol/L上升至10.86±0.77umol/L (P<0.05),亲本株细胞对顺铂耐药性显著增加；细胞凋亡实验结果显示,与未转染组相比,RBAP48-pEGFP-N1转染组细胞凋亡率无显著性改变,提示调节RBAP48的表达对肺癌细胞的凋亡率无显著影响(P>0.05)；细胞周期实验结果显示,与未转染组相比,RBAP48-pEGFP-N1转染组细胞周期分布无明显变化,但可逆转顺铂所致的细胞S期阻滞；β-半乳糖酐酶实验结果显示,与未转染组及顺铂对照组相比,BAP48-pEGFP-N1转染组细胞未见明显的衰老现象发生,并可逆转顺铂所致的衰老诱导作用。结论：1. RBAP48在肺癌顺铂耐药性形成过程中可能发挥着重要的调控作用。2、以靶向siRNA沉默细胞中RBAP48的表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖并提高细胞对顺铂的敏感性,其可能是通过阻滞细胞周期及诱导细胞衰老实现的。三、RBAP48基因调控肺癌细胞增殖及顺铂耐药性的机制研究目的：通过检测调节RBAP48基因对肺癌细胞PcG核心亚基、组蛋白转录协调因子、细胞周期及衰老调控等相关蛋白表达的影响,初步探究调节RBAP48基因表达影响肺癌细胞增殖及顺铂耐药性的分子机制。方法：分别以RBAP48-siRNA、RBAP48-pEGFP-N1调节A549/DDP细胞和A549细胞中RBAP48基因的表达,Western blot观察其对PcG核心亚基EZH2、Bmi-1以及H3K27me3、Acety-H3K27、ubi-H2AK119等组蛋白转录协调因子表达水平的影响,检测其对细胞衰老信号通路INK4a/ARF/Rb靶位中P16、P14、Rb、P53、E2F1等核心蛋白表达的影响,探究其对细胞周期调控信号通路中P21、P27、CyclinD1、CDK2、CDK4等关键调控蛋白表达的影响。结果：1、Western blot结果显示,沉默A549/DDP细胞中RBAP48基因,可显著下调耐药株EZH2、Bmi-1、H3K27me3、ubi-H2AK119的表达,上调Acety-H3K27的表达。2、过表达A549细胞中RBAP48基因,可显著下调Acety-H3K27的表达,上调EZH2、Bmi-1、H3K27me3、ubi-H2AK119的表达。2、沉默A549/DDP细胞中RBAP48基因,可显著上调耐药株P16、P14、pRb和P53的表达,下调E2F1的表达；过表达A549细胞中RBAP48基因,可上调E2F1的表达,下调P16, P14、Rb和P53、E2F1的表达。3、沉默A549/DDP细胞中RBAP48基因,可显著下调耐药株CyclinD1、CDK2和CDK4的表达,上调P21和P27的表达；过表达A549细胞中RBAP48基因,可显著下调P21和P27的表达,上调CyclinD1、CDK2和CDK4的表达。以上比较均具有统计学差异(P<0.05)。结论：1、RBAP48调控肺癌细胞增殖和顺铂耐药性可能是通过PcG介导的组蛋白表观修饰及其所致的靶基因沉默效应而实现的。2、沉默RBAP48的表达可解除PcG所介导的基因沉默效应,激活INK4a/ARF/Rb细胞衰老通路以及相关周期关键调节因的表达,阻滞细胞周期并诱导细胞衰老,从而抑制肿瘤细胞增殖并逆转其顺铂耐药性。3、RBAP48有望成为逆转肺癌顺铂耐药的新作用靶点。