氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的一个重要特点是膜上有丰富的脱氢酶,能够立体选择性氧化多种羟基化合物生成相应的醛、酮或酸。这一特性使得它在生物工业领域有着广泛的应用,其中利用其膜结合PQQ依赖型山梨醇脱氢酶(mSLDH,由sldAB基因编码)迅速有效地将甘油氧化为二羟基丙酮(DHA)的工业生产就是典型的例子之一。在本实验室前期的工作中,通过基因工程的方法对氧化葡萄糖酸杆菌的膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶基因(mGDH,由mgdh基因编码)进行敲除,从而去除了由于该酶的存在而导致细胞在葡萄糖发酵液中易酸化的途径,成功实现了用相对廉价的葡萄糖培养基得到更多G.oxydans菌体,降低其工业成本。在此基础上,本课题将进一步在mGDH基因敲除菌上构建针对于DHA生产的低成本、高产出菌。主要是对mGDH基因敲除的G.oxydans进行分子改造及调控代谢网络,通过优化菌株对葡萄糖的利用和提高DHA生产能力整合起来进行研究,从而达到降低其生产成本和提高菌株催化DHA能力的目的。同时研究了葡萄糖对G.oxydans酶表达量的影响,为进一步挖掘开发G.oxydans的催化能力提供一定理论依据。主要研究内容如下:　　1、比较G.oxydans DSM2003和621H两种静息细胞对甘油、乙二醇或乙醇的催化能力,并研究了溶氧对催化反应的影响。两种G.oxydans氧化甘油的能力都比较强,但是在溶氧水平较低时G.oxydans621H生产DHA的能力更强。G.oxydans DSM2003能够将乙二醇几乎全部氧化为羟基乙酸(副产物少),但仍然会剩余较多底物。G.oxydans621H生产羟基乙酸和乙酸的能力都很低。　　2、在mGDH基因敲除菌上构建针对于DHA生产的低成本、高产出的基因工程菌。将mgdh基因缺失的GDHK菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上经过50天实验室适应性进化实验,得到GDHE菌株。在GDHE菌基因组上对adhA基因进行缺失,去除甘油代谢的另一支路,得到GDHE△adh菌株。分别将具有不同启动子能过表达sldAB基因的表达载体转入到GDHE△adh菌株,但所得到的GDHE△adhoBBR-PtufbsldAB和GDHE△adh pBBR-sldAB突变株的生长明显变弱。将葡萄糖作为唯一碳源,对上述这两种菌株进行实验室适应性进化,得到葡萄糖培养基上生长情况得以改善的GAT和GAN两株菌株。　　3、比较山梨醇和葡萄糖培养基上G.oxydans基因工程菌生产DHA的能力,同时初步探讨了葡萄糖对G.oxydans相关酶和代谢的影响。实验结果表明,葡萄糖培养基上得到的GAN菌株静息细胞氧化甘油为DHA的能力最强,达到预期的目的。首次报道葡萄糖可能会诱导包括膜结合山梨醇脱氢酶,膜结合乙醇脱氢酶和葡萄糖酸脱氢酶在内的某些脱氧酶的表达。