研究背景及目的牙周病是造成成人牙齿缺失的第一大疾病。大量的实验研究、流行病学资料和临床观察证明,牙周病是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周病的始动因子,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)就是最为常见的,且目前公认的牙周致病菌之一。研究表明,P. gingivalis可以附着在颊粘膜、牙周袋上皮细胞以及通过细菌的共聚作用附着于菌斑中其他细菌的表面,如伴放线放线杆菌、具核梭杆菌等；可以产生牙龈素、胶原酶、脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)等毒力因子,并对牙周组织产生破坏作用,使附着丧失、牙槽骨吸收增加,进而造成牙齿松动脱落；此外P. gingivalis还可以侵入到宿主细胞内,使得其自身可以逃避宿主的先天性免疫防御。侵入宿主细胞内的P. gingivalis不但可以在细胞内长期生存,还能通过细胞间桥扩散感染临近细胞。目前关于牙龈卟啉单胞菌对牙周病发生发展的作用机制尚未完全阐明。以往的实验研究主要针对牙龈卟啉单胞菌的某一毒力因子对牙周组织或细胞的作用来研究其致病机制,但由于寄居在宿主体内的细菌多是以活体状态存在,而细菌的某些毒力因子,如LPS只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细胞后才释放出来,因此对于细菌单一组分在疾病中作用的研究并不能反应疾病的真实状态,而且也有相关研究表明,活体P.gingivalis与其毒力因子组分在宿主细胞中所引发的反应并不完全一致。本研究通过探讨寄居在人牙周膜细胞内的活体P. gingivalis对人牙周膜细胞的生物学形态、增殖、成骨向分化等生物学性能的影响,为牙周病发病机制的研究提供相关实验依据。研究内容第一章人牙周膜细胞的体外分离培养和鉴定目的：体外分离培养人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells, hPDLCs),观察人牙周膜细胞体外培养的形态特点,对其来源进行鉴定,为下一步实验提供基础。方法：1.取12～25岁正畸患者因治疗需要减数拔除的,牙周及牙体均健康的前磨牙,无菌条件下刮取根中三分之一牙周膜组织,改良组织块酶消化法进行原代培养并传代。取生长状态良好的第3代细胞,倒置相差显微镜观察其生长形态及特征。2.取生长状态良好的第3代细胞,通过免疫荧光化学法进行波形丝蛋白、角蛋白染色,鉴定人牙周膜细胞来源。3.取对数生长期的第3代hPDLCs, MTT (5-diphenyl tetrazolium bromide,四甲基偶氮唑盐)法连续检测hPDLCs七天的细胞增殖活性,绘制细胞生长曲线。结果：1.原代培养5-10天左右可见有成纤维细胞从组织块周边游出,高倍镜下观察可见细胞呈长梭形或星形,胞体丰满,胞质均匀,中央有圆形或卵圆形的胞核,核仁清晰可见,为成纤维样细胞。传代后的细胞24h内可贴壁,贴壁后增殖速度快,渐伸展为不规则圆形、多角形、梭形,呈放射状排列。2.免疫组化及免疫荧光结果显示：波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,表明培养的细胞来源于间叶组织。3. hPDLCs接种1～2天时细胞增长缓慢,3天后增殖迅速,7天左右到达平台期,符合体外培养细胞的生长规律,其生长曲线呈倒“S”型,说明细胞增殖能力良好。结论：改良组织块酶消化法成功分离培养hPDLCs,所获得的细胞呈纤维样,且保持了间充质来源细胞群的特性,增殖能力良好,可满足后续实验需要。第二章牙龈卟啉单胞菌的体外培养和鉴定目的：体外培养人牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis),观察其体外培养的形态特点,对其进行菌种鉴定,供后续实验使用。方法：将冻存的P. gingivalis菌株ATCC33277复苏后接种于BHI羊血琼脂培养基(含50mL/L冻溶羊血、5mg/L氯化血红素和1mg/L维生素K3),37℃厌氧培养(80%N2、10%CO、10%H2),观察菌落的生长形态,并进行革兰氏染色。细菌培养7d后,用无菌枪头挑取一个单菌落至2mL BHI液体培养基中,37℃厌氧培养约24h,取1mL混浊的菌液送至生工生物工程(上海)有限公司进行16s rDNA菌种测序鉴定。结果：1.牙龈卟啉单胞菌固体培养基培养3d后,培养皿上有菌落形成,菌落为白色,直径约0.5-1mm,突起于培养基表面,质硬,与培养基表面黏附较紧；培养7d后,菌落由白色变成黑色。革兰氏染色结果显示,牙龈卟啉单胞菌呈红色球杆状,为革兰氏阴性菌。2.16s rDNA测序结果证明所挑选细菌为P. gingivalis ATCC33277。结论：采用厌氧培养法成功培养牙龈卟啉单胞菌,并证实其为P. gingivalis标准株ATCC33277。第三章牙龈卟啉单胞菌对人牙周膜细胞侵袭效能的比较研究目的：比较不同感染复数(Multiplicity of infection, MOI)和侵袭时间下,活体P. gingivalis对hPDLCs的侵袭效能,构建牙龈卟啉单胞菌活菌胞内感染人牙周膜细胞的体外模型,为下一步实验提供基础。方法：1.将hPDLCs和P. gingivalis分别以MOI为10和100共培养90min、8h、24h后,利用细胞侵袭实验和流式细胞仪分析比较不同时间及MOI值下,P. gingivalis对hPDLCs的侵袭效能。2.将hPDLCs和荧光标记过的P. gingivalis以MOI为10共培养24小时后,使用Alexa Fluor(?)594 Phalloidin标记细胞骨架中的F-actin, DAPI复染细胞核,激光扫描共聚焦显微镜下观察P. gingivalis侵入细胞的情况。结果：1. hPDLCs和P. gingivalis共培养90min后,P. gingivalis即可进入细胞内,共培养24h后,侵袭效能达到最大值。2.MOI=10或100时,肉眼可见培养皿上P. gingivalis菌落数无明显差别,提示MOI为10或100时,P. gingivalis对hPDLCs的侵袭效能并无明显差别。3.激光扫描共聚焦显微镜下观察结果显示：被荧光染料SYTO-9标记的呈现绿色荧光的P. gingivalis位于hPDLCs的胞浆内,且主要分布在核周,且几乎所有的细胞内都可观察到绿色荧光。结论：成功建立了P. gingivalis侵袭hPDLCs的体外模型。侵袭效能最大的时间为24h,当MOI为10或100时,牙龈卟啉单胞菌侵袭效能并无明显差异。第四章牙龈卟啉单胞菌对人牙周膜细胞增殖和成骨向分化的影响目的：探究侵入hPDLCs的活体P. gingivalis对细胞的生物学形态、增殖性能及成骨向分化的影响。方法：1.透射电子显微镜观察P. gingivalis对hPDLCs生物学形态的影响。2. CFDA-SE标记hPDLCs,加入P. gingivalis后分别共培养8h、24h、48h、 72h,流式细胞仪检测细胞增殖性能的变化。3.流式细胞仪检测P. gingivalis对hPDLCs凋亡的影响。4.将SYTO-9标记的P. gingivalis与hPDLCs共培养24h后,荧光激活细胞分选术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)分选出被P. gingivalis感染细胞,对分选出的细胞hPDLCs进行矿化诱导,正常的hPDLCs作为对照,分别于7d、14d、21d进行茜素红染色检测hPDLCs矿化结节形成。5.实时荧光定量逆转录PCR(Quantitative Real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术和免疫印迹技术(Western Blot, WB)检测hPDLCs中矿化相关转录因子(Runt-related transcription factor 2, Runx2)在nRNA和蛋白质水平的变化。结果：1.透射电镜观察结果显示：侵入hPDLCs的P. gingivalis能够在细胞内存活,但未改变细胞结构的完整性。2.流式细胞仪检测结果显示：P. gingivalis分别感染hPDLCs 8h、24h、48h、72h后,细胞除少量自增殖外,没有发生明显的增殖改变。3.细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI流式检测显示：P. gingivalis感染hPDLCs后,出现凋亡的细胞数无明显变化。4.矿化诱导实验结果显示：P. gingivalis感染hPDLCs后,细胞矿化结节的形成明显减少。5. qRT-PCR实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示：P. gingivalis感染hPDLCs后,细胞Runx2 mRNA和蛋白质表达水平明显下调。结论：侵袭进入hPDLCs内的活体P. gingivalis可在细胞内存活,且未对细胞的生物学形态、细胞凋亡、增殖能力产生明显的影响,但可以明显抑制hPDLCs的成骨向分化,这可能是通过下调Runx2的表达来实现的。