食管癌(Esophageal Cancer,EC)是高发的消化道肿瘤之一,在恶性肿瘤中死亡率较高。食管癌发病主要分为2个病理类型,食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)大约占4/5,其余为食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)。美国等西方国家食管癌主要是腺癌,亚洲地区和中国主要是鳞癌。中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,河南林州、河北磁县以及涉县等食管癌高发区,发病率甚至达世界平均水平的10倍。全球癌症生存情况监测报告2010-14(CONCORD-3),大多数国家和地区的食管癌患者5年生存率在10-30%之间,而中国食管癌患者的5年生存率仍然较低。ESCC仍然严重威胁人类的健康。侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征,是最终导致食管癌患者死亡的主要原因。目前的ESCC西医治疗方案对侵袭和转移没有良好效果,即使手术切除或者广泛应用全身放化疗,患者总生存率仍然不容乐观。食管癌的侵袭和转移主要原因是ESCC细胞迁移和侵袭的过程十分复杂,许多机理尚不十分清楚。因此,探寻ESCC迁移和侵袭的调控过程显得尤为重要。启膈方(Qigefang,QGF)是启膈散化裁而成,启膈散由中国清代名医程钟龄所创制,他的著作《医学心悟》记载主要用于噎膈治疗。河北省是中国食管癌最高发区域之一,因此我们临床接诊了大量食管癌患者,结合食管癌的病因病机和患者临床表现,启膈方广泛用于食管癌治疗。临床研究表明QGF能够明显改善食管癌术后患者症状,并显示出抑制食管癌复发转移的趋势。但QGF抑制食管癌细胞侵袭和迁移的具体机制仍然不是很清楚。有研究表明生长抑制特异性基因6(Growth arrest-specific 6,Gas6)和受体酪氨酸激酶Aexelekto(Axl)在口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)等肿瘤组织和细胞高表达,而Gas6与Axl的结合改变了细胞的功能,包括迁移、增殖和存活;最近的一些研究表明Gas6/Axl影响前列腺癌细胞骨髓转移过程中的侵袭和存活,还有报道显示Gas6/Axl在胃癌、肺癌的侵袭和转移中起到促进作用。有研究报道Gas6/Axl–PI3K/AKT通路促进OSCC侵袭,Gas6/Axl-NF-κB通路增强OSCC细胞侵袭/迁移能力。然而,Gas6/Axl如何介导食管癌细胞迁移和侵袭的过程还不清楚,是否通过增强相关信号通路而发挥促进作用有待进一步研究。本研究前期蛋白芯片结果显示QGF能够降低食管癌细胞Gas6的表达。有报道表明Gas6在食管癌形成中的促进作用。所以我们假设QGF是通过抑制Gas6蛋白,调控Gas6/Axl信号传导通路进而抑制PI3K/AKT和NF-κB等下游蛋白表达,同时影响上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生,来抑制食管癌细胞侵袭和迁移功能。本研究旨在探讨QGF对食管癌细胞Gas6/Axl及下游信号通路的调控,以及抑制细胞侵袭和迁移的作用,为QGF治疗食管癌提供理论依据。为探讨上述问题,本研究选取食管癌患者术后癌组织和癌旁组织,以及人鳞状上皮食管癌细胞ECA109、TE1、TE13作为研究对象,分为三部分来进行实验研究。第一部分人食管鳞状细胞癌组织Gas6和Axl的表达目的:观察人食管癌组织和癌旁组织中Gas6和Axl的表达及与肿瘤标志物相关性。方法:1.随机选取人食管癌组织和癌旁组织制作病理切片。2.HE染色检测确认食管癌病理诊断和类型。3.免疫组织化学法测定食管癌组织和癌旁组织Gas6蛋白表达。4.免疫荧光法和激光共聚焦显微镜测定Axl在食管癌组织和癌旁组织的表达。5.电化学发光法测定食管癌患者肿瘤标志物。结果:1.食管癌组织和癌旁组织经HE染色观测,镜检显示食管癌组全部为鳞癌,与癌旁组织相比,细胞变性、膨大,且呈不规则性和显著的异型性,细胞核变大且染色较深;2.食管癌和癌旁组织Gas6的免疫组化结果显示:食管癌组织和癌旁组织的Gas6表达均增加,并且ESCC组Gas6的表达量显著高于癌旁组织NC组。食管癌患者Gas6表达水平与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1表现正相关性;3.食管癌和癌旁组织免疫荧光和激光共聚焦观察显示:Axl在ESCC癌组织和癌旁组织免疫荧光表达增加,而且ESCC组Axl的表达量显著高于癌旁组织NC组。食管癌患者Axl表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1呈正相关性。小结:人食管鳞状细胞癌病理组织中Gas6和Axl的表达及活性显著增加,然而癌旁组织的表达不明显或者较少表达。食管癌患者Gas6和Axl表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1表达呈正相关关系。第二部分启膈方通过调控Gas6/Axl抑制食管癌细胞的移动能力目的:将食管癌Eca109、TE1细胞作为实验对象,对Gas6/Axl进行细胞共定位,验证QGF对Gas6/Axl复合物的调控作用,影响磷酸肌醇激酶3(Phosphoinositide 3-kinases,PI3K),蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)与核转录因子B(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)等下游信号通路,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。方法:1.应用CCK-8实验检测分析QGF对食管癌细胞细胞毒性影响,从而选择细胞迁移和侵袭相关实验干预浓度。2.使用Perkin-Elmer高内涵细胞成像系统及Harmony图像分析软件对食管癌细胞的运动能力和运动距离进行检测。3.免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测Gas6、Axl以及Gas6/Axl在食管癌细胞的定位和结合情况,以及QGF干预的调节作用。4.用免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测PI3K,AKT和NF-κB在食管癌细胞的定位和表达,以及QGF干预后对PI3K,AKT的影响和NF-κB入核的变化。5.Western blotting检测食管癌细胞Gas6、Axl、PI3K、AKT、NF-κB,及金属基质蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP2)和金属基质蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP9)的蛋白表达情况,及QGF干预后的变化。6.QGF对食管癌细胞迁移能力的测定选用体外划痕方法。7.QGF对食管癌细胞侵袭能力的作用采用Transwell实验方法。结果:1.QGF实验干预药物浓度确定。CCK-8分析QGF浓度选择实验证明,QGF对食管癌细胞ECA109和TE1干预后,400μg/ml呈现出对细胞增殖的抑制(细胞毒性作用),而200μg/ml及以下则没有;培养时间48小时表现出抑制细胞增殖(细胞毒作用),24小时则没有。因此,确定≤200μg/ml为适合干预浓度,时间为24小时;2.QGF降低食管癌细胞的移动速度和移动距离。高内涵细胞成像实验显示,QGF的刺激能够显著的降低食管癌细胞ECA109和TE1的运动速度,且能够减少食管癌细胞的有效运动距离,而这些抑制作用表现出明显的浓度依赖性趋势。3.QGF调控Gas6和Axl在细胞膜的表达及Gas6/Axl复合体的结合。免疫荧光和激光共聚焦结果显示,食管癌细胞中Gas6和Axl主要表达在细胞膜,并在膜形成复合体;QGF干预食管癌细胞后,能够明显抑制Gas6和Axl在细胞膜的结合,并出现分离的趋势,而且随着干预浓度的加大,调控作用越来越明显。4.QGF抑制PI3K/AKT和NF-κB的表达。实验通过免疫荧光方法检测食管癌细胞PI3K/AKT和NF-κB,结果表明与对照组相比,QGF组能够明显抑制PI3K和AKT的表达,降低NF-κB进入到细胞核,并且这些抑制作用呈现出一定的浓度依赖趋势。5.QGF抑制Gas6/Axl下游信号通路的蛋白表达。Western blotting的结果显示,QGF的刺激显著降低了食管癌细胞Gas6、Axl的表达并显示出浓度依赖性趋势。QGF刺激显著降低了P-PI3K,P-AKT和P-NF-κB的蛋白表达,并显示了浓度依赖的趋势。QGF刺激显著降低了MMP2和MMP9的蛋白质表达,并随着浓度加大而增强。在食管癌细胞ECA109和TE1中发现了相同的浓度依赖趋势。6.QGF抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。划痕实验结果表示,与对照组相比,QGF浓度为200μg/ml,明显抑制了TE1细胞在12h内的细胞迁移。更重要的是,我们观察到100,200μg/ml组与对照组相比,在24 h时能显著抑制细胞迁移,两种细胞的趋势相同。7.Transwell实验结果显示,与对照组相比,QGF浓度为100,200μg/ml,逐渐减少了通过Transwell小室的细胞数量,并显示出浓度依赖性,两种细胞的趋势相同,但是200μg/ml的效果好于100μg/ml组。小结:在食管癌细胞ECA109和TE1中Gas6和Axl高表达。QGF通过调控Gas6和Axl在细胞膜的结合,抑制下游蛋白表达,降低NF-κB的入核,阻断该信号通路传导,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。第三部分启膈方调节Gas6/Axl抑制EMT影响食管癌细胞迁移和侵袭的研究目的:观察QGF通过调控Gas6/Axl抑制食管癌上皮间质转化(EMT)发生影响肿瘤细胞迁移和侵袭的机制方法:1.免疫双荧光共定位检测食管癌细胞Eca109,TE13的Gas6和Axl共定位并检测启膈方的干预作用。2.Western blotting检测EMT标志物E-Ca,N-Ca和Snail1的蛋白表达及QGF的干预作用。3.免疫荧光检测QGF对食管癌细胞EMT标志物E-Ca,N-Cad和Snail定位。4.鬼笔环肽细胞骨架实验测定QGF对食管癌细胞形态的干预作用。5.划痕和Transwell方法测定QGF对食管癌细胞运动能力的作用。结果:1.QGF抑制Gas6/Axl复合物的结合。免疫荧光实验结果表明,食管癌细胞Eca109和TE13中对照组Gas6和Axl主要在细胞膜形成复合物;与对照组相比,QGF干预食管癌细胞后,能够明显抑制Gas6和Axl在细胞膜的绑定结合,Gas6/Axl出现分离的趋势,而且随着干预浓度加大,调控作用越来越明显;2.QGF抑制食管癌细胞EMT的形成免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察显示,与对照组相比,随着QGF的干预,E-ca在细胞膜的表达逐渐升高,呈现浓度依赖性。与E-ca相反,QGF的刺激浓度增加,N-ca和Snail在细胞膜的表达逐渐降低,呈现浓度依赖性,在两种食管癌细胞也观察到大致相同的趋势。Western blotting测定结果表示,与对照组相比,QGF干预能显著增加E-ca蛋白的表达,显著降低N-ca和Snail蛋白的表达,并且在两种细胞系表现出同样的趋势,呈现浓度依赖性;3.QGF能够促进食管癌细胞微丝骨架的重排。细胞微丝骨架染色实验表明,与对照组相比,QGF刺激食管癌细胞后,细胞中的微丝排列变得更加规则,细胞的微丝骨架同向性更强,细胞形态也更加规则,并且呈现出浓度依赖的趋势;4.QGF抑制ECA109和TE13细胞的迁移和侵袭。划痕实验结果表示,不同浓度QGF干预食管癌细胞24小时,与对照组相比,QGF明显抑制了细胞的迁移能力,呈现明显的浓度依赖性,且在两种细胞系观察到同样的趋势。Transwell实验结果显示,与空白组相比,随着QGF浓度的增加,通过Transwell小室的细胞数量逐渐减少,两种细胞趋势相同,但200μg/ml的效果明显好于100μg/ml组。小结:QGF能够显著调节食管癌细胞Eca109和TE13中Gas6/Axl的表达和抑制复合体在细胞膜形成,抑制肿瘤细胞上皮间质转化的形成,进而影响食管癌细胞的迁移和侵袭。结论:1.ESCC癌组织中Gas6和Axl的表达及活性显著增加,并且Gas6和Axl的表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1的值呈正相关性。2.QGF能够调控食管癌细胞Gas6/Axl信号通路和蛋白表达。3.QGF的能够降低Gas6的表达,抑制Gas6/Axl的结合,并减少NF-κB进入细胞核,降低下游蛋白的表达,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。4.QGF通过调控Gas6/Axl信号传导通路进而抑制EMT形成,影响食管癌细胞迁移和侵袭,从而防止食管癌转移。