研究背景急性高原病是人类在高原低氧自然环境下引起的以心、肺、脑等多器官损伤为特征的疾病。高原肺水肿(high altitude pulmonary edema, HAPE)是一种严重危及生命的急性高原病,常发生于平原初入或再入高原者,多见于海拔2,500米以上地区。HAPE发病急、病情发展快,若不及时治疗,常有生命危险。大量流行病学观察资料显示,同样在高原低氧环境下,人们对HAPE易感性存在明显个体差异性。目前,学术界对其病因的基本共识是,HAPE是由多种遗传因素和环境因素共同作用而导致的复杂性疾病。然而,其发病机制尚未明了,研究遗传易感性和个体对抗高原极端环境及药物反应的差异一直是HAPE防治的重要课题。人类基因组计划和国际单倍型图谱的构建完成,为HAPE的候选基因研究及从基因水平探索其个体差异性提供了理论支持和信息平台。HAPE发病的主要特点包括低氧性肺血管反应性增高、低氧性肺通气反应降低和水盐代谢障碍。与这三个特点有关的基因成为HAPE的候选易感基因。有证据表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统、影响水盐代谢功能的肺泡上皮钠水主动转运系统和参与低氧应激反应的热休克蛋白家族的基因等可能参与HAPE的发病。另有研究提示,这些蛋白编码基因的多态位点与HAPE易感相关,但这种关联在不同人群中不能相互印证。可能的原因是不同种族由于多态性频率的差异形成了种族特异的遗传结构,从而造成在不同研究人群某一特定变异的作用不尽相同。因此,在不同种族人群中建立HAPE的遗传资源库是非常必要的。对多个位点进行研究,尤其是大规模的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点间的相互作用分析,是现今研究人类疾病的一个主要方向。这种基于多位点单倍型传递的分析所提供的信息量要比单个位点更多、更准确、更有效,成为群体遗传学研究和疾病相关基因检测的重要工具。本研究以青藏铁路建设为背景,采用候选基因关联分析方法,研究HAPE遗传易感性的分子机制,旨在从分子水平揭示HAPE的遗传学基础,阐释遗传因素与环境因素相互作用的病因学机制,为高危人群风险预测提供科学依据和技术方法,以减少发病率,提高治疗率。第一部分　高原肺水肿候选基因的关联研究目的本文以青藏铁路筑路工人为研究对象,对284例样本进行病例-对照关联分析,高原肺水肿(HAPE)组140例,正常对照(healthy control, HC)组144例。对9个HAPE候选目标基因的18个SNP进行分型。采用多位点的单倍型预测和交互效应分析方法,检测与HAPE相关的SNP特异单倍型组合,并探索可能存在的基因-基因间的相互作用。本文首次引入多元简约法(MDR),可大大提高结果分析的力度和可信性。方法1)样本选择：根据HAPE的诊断标准,从青藏铁路筑路工人中选取140例HAPE患者和144例严格匹配的HC个体。2)SNP分型：PCR-RFLP, PCR-SSCP结合PCR测序技术鉴定SNP的基因型。结果单个位点分析1)肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中,单位点分析结果显示：醛固酮合成酶基因(CYP11B2) C-344T, K173R位点和血管紧张素转换酶基因(ACE)A-240T位点与HAPE易感显著相关(P<0.0050)。2)肺泡上皮钠通道蛋白α亚基(αENaC)基因(SCNN1A)：A663T位点的等位基因频率在两组间的分布存在统计学差异(P=0.0227)3)热休克蛋白70家族基因(HSP70)：热休克蛋白70-1基因(HSPAIA) A-110C多态位点的基因型(P=0.0314)及等位基因(P=0.0247)频率在两组间的分布存在统计学差异。连锁分析对RAAS系统5个基因中的10个SNP进行连锁分析。在两组中,CYP11B2C-344T和K173R两位点间连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)程度很强(HAPE组D’=0.94和HC组D’=0.97)。对HSP70家族中3个基因的5个SNP进行连锁分析,在两组中热休克蛋白70-2基因(HSPAIB) G2074C及热休克蛋白70-hom (HSPA1L) T2437C两位点完全连锁(HAPE组D’=1.00和HC组D’=1.00),在HC组中T2437C分别与HSPAIB A1267G或HSPA1AG190C两位点间完全连锁(D’=1.00),而在HAPE组中A1267G与G190C两位点间存在中度连锁(D’=0.61)。基因-基因间交互效应分析及单倍型预测1)应用MDR软件,在RAAS系统基因中选择了5个SNP,包括血管紧张素原基因(4GDM235T; ACE A-240T, A2350G;缓激肽B2受体基因(BKB2R)C-58T和CYP11B2C-344T位点。最佳MDR模型包括：A-240T,A2350G和C-344T位点,其中A-240T和A2350G存在强交互效应,同时与C-344T具有中等程度交互效应。对最佳MDR模型中3个SNP进行单倍型分析,经Bonferroni校正(P<0.0050,0.05/10),发现在HAPE组中单倍型H4(A-G-T,等位基因按照A-240T,A2350G和C-344T顺序组合单倍型)的频率显著高于HC组(31.1%vs.16.6%,P<0.0001),单倍型H7(T-G-A)的频率显著低于HC组(5.8%vs.14.3%,P=0.0008)。2) SCNN1A基因中3个SNP进行单倍型分析,经Bonferroni校正(P<0.0167,0.05/3),发现在HAPE组中单倍型H2(C-C-A,等位基因按照C+7T,T334A和A663T顺序组合单倍型)的频率显著低于HC组(25.5%vs.36.0%,P=0.0067)。MDR交互效应分析结果显示,3个SNP存在较弱的交互效应。3)HSP70基因中5个SNP进行交互效应分析发现,A-110C和A1267G存在强交互效应,同时与G190C存在中等程度的交互效应。对这3个SNP进行单倍型分析,经Bonferroni校正(P<0.0100,0.05/5),发现在HAPE组中单倍型H5(G-G-A,等位基因按A1267G,G190C和A-110C顺序组合单倍型)和单倍型H7(G-C-A)的频率显著低于HC组(Hs：1.3%vs.7.7%,P=0.0003；H7：1.4%vs.8.10%,P=0.0002),单倍型H8(G-C-C)的频率显著高于HC组(23.9%vs.13.0%,P=0.0008)。4)多个候选通路、基因、SNP进行交互效应分析,MDR最佳模型中包括5个SNP:A1267G, A663T, C-344T, A2350G和A-240T。进行单倍型分析,经Bonferroni校正(P<0.0028,0.05/18),发现在HAPE组中单倍型H6(A-A-T-A-A,等位基因按A-240T, A2350G, C-344T, A1267G和A663T顺序组合单倍型)的频率显著高于HC组(7.2%vs.0.9%,P=0.0002)第二部分转铁蛋白相关等位基因及其单倍型的功能研究目的本文比较分析HAPE患者及HC个体的血浆蛋白质组分的差异,将HAPE患者特异变化的血浆蛋白质的编码基因作为目标候选基因,研究其与HAPE发病机制的关系。蛋白质组学研究通过柱层析除去高丰度的血浆白蛋白,采用双向电泳和质谱分析比较两组中血浆蛋白质组分和含量的变化,鉴定出差异显著的蛋白质种类。结果显示,HAPE组中转铁蛋白(transferrin, TF)含量水平较HC组明显升高。群体关联研究根据蛋白质组学研究结果,HAPE患者血浆TF水平较HC组有明显升高。推测有以下可能：①HAPE患者TF变异,不能与转铁蛋白受体(transferrin receptor, TFR)结合,致使血浆中TF增多；或TFR结构变异。②TF基因调控区多态性,在环境因素作用下使其表达调控水平改变。③或其它。本文的研究方向主要从基因调控方面着手。采用基因组学研究方法,对两组的TF基因启动子区和第一内含子区的全序列进行测定并比较分析,发现7个SNP,分别为A-740G,G-618A, G-552A, T+463C, A+1138G, G+1649A单核苷酸取代和G-35T单碱基颠换。应用病例-对照关联分析方法发现：(1)除G-35T和G+1649A位点的基因型频率在HAPE组高于HC组外,未见其余SNP的基因频率在两组有明显差异。(2)单倍型分析结果表明：根据MDR分析结果,选择存在明显交互效应的启动子区4个SNP进行单倍型分析。主要存在9种单倍型,其中HAPE组单倍型H4(G-G-G-T,等位基因按照A-740G, G-618A, G-552A和G-35T顺序组合单倍型)频率显著高于HC组(P=0.0085),说明其与HAPE易感相关；相反,HC组单倍型H6(A-G-A-T)频率显著高于HAPE组(P=0.0012),提示该单倍型携带者不易患HAPE,是其抗性基因组合。转录活性研究为进一步证实和解释遗传关联分析的结果,鉴定存在于TF基因邻近启动子区的SNP及其不同单倍型对基因调控区转录活性的影响,本研究构建了含TF基因邻近启动子区不同单倍型的萤光素酶报告基因重组质粒,体外转染人肺腺癌A549细胞并测定其瞬时表达萤光素酶活性,对TF基因邻近启动子区的4种主要单倍型的序列进行功能研究,以期进一步阐明基因结构和表型之间的内在联系。1)萤光素酶报告基因表达质粒的构建从基因组DNA中用PCR方法扩增,获得含有人TF基因5’上游调控区不同单倍型的片段。所得目的片段亚克隆入pMD18-T vector.将pGL3-Basic/Enhancer vector和重组pMD18-T质粒经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后得到的含粘端的片段相连接,得到含不同单倍型的人TF基因5’上游调控区序列的萤光素酶报告基因重组质粒。2)人肺腺癌A549细胞系的培养及诱导过程HAPE是一种非心源性水肿,主要受累组织器官是肺脏,故采用人肺腺癌A549细胞系作为转染的宿主细胞。培养人肺腺癌A549细胞,观察它的增殖过程。使用F12培养基(含有10%胎牛血清),人肺腺癌细胞在第3-8天时为对数增殖期。3)不同单倍型对转录活性的影响利用真核基因转染技术,将构建好的重组质粒与内参照质粒pRL-TK共转染人肺腺癌A549细胞,探讨位于TF基因5’调控区的SNP及其单倍型组合对报告基因转录活性的影响。体外转染增殖期人肺腺癌A549细胞,瞬时表达结果显示：含易感单倍型重组质粒的报告基因荧光素酶表达活性高于含抗性单倍型重组质粒,并均低于pGL3-promoter plasmid。4)低氧环境下不同单倍型对转录活性的影响为进一步说明基因结构对HAPE发生的影响,本研究模拟低氧环境(环境物理低氧：3%02和细胞化学低氧：100μmol/L COCl2),将含有TF基因邻近启动子区的4种主要单倍型序列的萤光素酶报告基因重组质粒瞬时转染人肺腺癌A549细胞,在不同低氧环境下培养,分别测定萤光素酶活性。结果显示,在低氧条件下,含易感单倍型重组质粒的报告基因活性高于含抗性单倍型重组质粒,且低氧条件下重组质粒报告基因的表达水平高于常氧环境,具有一定的时间依赖性。总之,本研究利用群体关联方法分析了3个候选通路中9个候选基因的18个SNP与HAPE易感相关性。结果表明,单个位点与HAPE的易感相关性较弱,采用单倍型分析和多元简约法发现HSP70A1B基因A1267G, SCNNIA基因A663T,CYP11B2基因C-344T,ACE基因A2350G和A-240T多态位点之间的交互效应与HAPE易感相关。此结果提示在HAPE的遗传学研究中多位点的单倍型分析及基因-基因交互作用的估计较单个位点的分析具有潜在优势。同时本研究采用蛋白质组学及基因组学研究分析了HAPE组与HC组中血浆蛋白质组分的表达差异,鉴定并选择TF基因作为候选基因,研究其与HAPE易感相关性。应用体外转录研究从功能水平阐明基因结构和表型之间的内在关联性,结果显示位于TF基因5’调控区的SNP单倍型组合可能参与基因的转录调控。本研究首次从群体遗传学角度及候选基因途径,分析了多个候选通路、多个基因、多个SNP与HAPE的易感关联性,并在群体相关研究的基础上为进一步阐明其内在机制进行了相关基因的功能研究,至少为明确HAPE的病因提供了部分理论依据。