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猪的经济性状受数量性状基因座(QTL)控制,其中一些基因可能起主要作用,即主基因效应,通过候选基因法克隆研究猪的主效基因被广泛采用。平均日增重、背膘厚是猪的重要经济指标,在猪的遗传育种和性能测定上深受重视。本研究利用比较基因图谱,找到与猪4号染色体上平均日增重、背膘厚QTL区段同源的人1号染色体区段,从中选取了2个基因作为研究对象,这两个基因目前在猪中尚无研究报道。为了找到这两个基因与猪肌肉生长发育相关的证据,利用人的同源基因序列为探针搜索猪的EST数据库,根据EST拼接组成的序列设计引物,克隆得到了这两个基因的cDNA序列,进而得到了DNA序列和启动子序列,并从基因的染色体物理定位、组织表达谱、蛋白的亚细胞定位以及启动子的转录调控等方面对这两个基因进行了初步研究,获得了如下结果:
(1)首次克隆得到了猪NICE-3基因和pClorf77基因的完整CDS序列、基因组DNA序列及启动子序列,并确定了转录起始区域;其中NICE-3基因的基因组全长约12.6 kb,CDS序列长762 bp,启动子区长约2 kb,分为7个外显子和6个内含子,基因组DNA序列及启动子序列是利用筛选猪BAC文库的方法获得的;pClorf77基因的基因组全长约10.4 kb,CDS序列长750 bp,启动子区长约1.7 kb,分为6个外显子和5个内含子,启动子序列是利用同源比对法找到人和鼠该基因的同源区,据此设计引物扩增得到的。
(2)利用辐射杂种克隆板将猪NICE-3基因和pClorf77基因都定位在了猪4号染色体上,均与微卫星标记SW512距离最近,而SW512标记与背膘厚、眼肌面积、日增重、亚油酸及油酸含量等性状相关。
(3)实时荧光定量PCR结果表明猪NICE-3基因在肌肉组织(背最长肌、心肌、股二头肌)中表达量较高,其次是在肝、肾和背膘中:而pClorf77基因在肌肉组织(背最长肌、心肌、股二头肌)中表达量较高,在其它组织中相对较低。
(4)亚细胞定位实验结果表明猪NICE-3蛋白分布在核外,且并不局限于某种细胞器,在线粒体、高尔基体以及内脂网中均有表达;而pClorf77蛋白分布在核内。
(5)启动子活性分析实验结果表明猪NICE-3基因启动子区的-1341/-1649区段可能存在一个转录抑制子,在-1077/-1341区段至少存在着一个转录增强子,转录核心区域可能在-1077 bp到-1341 bp之间,位于-1213 bp~-1219 bp处的序列是一个非常重要的转录因子结合位点,它的定点突变对该启动子的活性影响很大,凝胶阻滞电泳实验证实了该基因启动子中-1213bp~-1219bp处的结合位点与转录因子RXR的结合;pClorf77基因的-420/-819区段可能是转录核心区域,位点特异性突变实验表明所研究的3个转录因子对该基因的转录都起着重要的作用,该启动子可能是多因子共同调控基因的转录。