精子发生是一个复杂的细胞分化过程,它是所有动物有性繁殖所必需的。该过程主要包括三个阶段:精原细胞的有丝分裂阶段,精母细胞的减数分裂阶段和圆形精子变态生成延长型精子的阶段。从分子水平上看,精子发生是一系列特定基因程序性表达和转录的过程。然而,迄今为止从分子水平上理解哺乳动物精子的发生过程十分有限。Slx-Like1(Slxl1),Scp3-like,X-linked,2(Slx2)和X-linked,lymphocyte-regulatedcomplex,5c(Xlr5c)是3个新发现的基因,有关它们的定位和功能目前还是空白。本文利用细胞生物学技术、发育生物学技术、分子生物学技术、RNA干涉技术以及转基因技术等手段研究这3个基因或蛋白在组织中的定位和功能,特别是在精子发生和减数分裂过程中所起的作用。本研究不仅有助于揭示精子发生的机理和减数分裂的调控机制;还可以帮助我们深入了解雄性不育的发生机制,为不育症的治疗和避孕药的研发提供理论依据。　　 线粒体所产生的ATP是哺乳动物细胞获得能量的主要来源。目前,对线粒体的分布、结构和功能的研究已经成为细胞生物学研究的热点。然而,线粒体在水牛生殖细胞中的定位、分布和功能鲜有文献报道。本文研究活性线粒体在水牛颗粒细胞、精子细胞、卵母细胞和早期胚胎发育过程中的凋亡、定位和位移变化趋势。本研究不仅有助于揭示颗粒细胞凋亡和卵巢闭锁的关系,还有助于进一步揭示水牛卵子成熟的机制;同时本研究建立了一种评价卵子发育潜能和胚胎发育潜能的评价指标,这有助于提高水牛卵母细胞体外成熟的效率和早期胚胎移植的效率,也可为人类辅助生育技术的发展开辟新的研究思路。　　 具体研究内容分为如下五个部分:　　 研究一,小鼠睾丸新基因Slxl1的克隆、表达和功能鉴定,该基因所编码的蛋白参与精子顶体的形成和精子受精的进程。　　 研究结果显示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR检测不同组织和不同阶段的睾丸发现,Slxl1mRNA在小鼠睾丸中特异性表达;(2)利用抗原设计、融合蛋白原核表达和抗体纯化制备技术获得了针对SLXL1蛋白的特异性多克隆抗体;(3)在蛋白水平上,利用免疫印迹技术检测不同组织和不同阶段的睾丸发现,Slxl1编码一个18kDa的蛋白并特异性的表达于睾丸组织中;(4)通过制备的多克隆抗体进行免疫组化试验发现,该蛋白定位在圆形精子、延长型精子、附睾精子和成熟精子的顶体上;进一步研究还发现,该蛋白的表达趋势与精子顶体的形成趋势一致,上述结果表明该蛋白参与了精子顶体的形成;(5)通过免疫共沉淀发现,该蛋白与精子的顶体蛋白DKKL1有相互作用并一起共定位在精子的项体上;(6)体外受精试验发现,应用制备的兔源多克隆抗体可封闭该蛋白并导致体外受精率严重下降,而对照组的受精率没有显著变化。上述结果表明Slxl1是一个睾丸特异性表达蛋白,也是一个精子顶体相关蛋白。该蛋白不但参与了精子项体的形成过程而且还参与了精子和卵子的受精过程。　　 研究二,小鼠Slx2基因的克隆、表达和功能鉴定,该基因所编码的蛋白参与了减数分裂过程中联会复合体的形成、同源染色体重组、DNA断裂修复和性染色体的失活等过程。　　 研究结果显示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR技术检测不同组织和不同阶段的睾丸和卵巢发现,Slx2mRNA只在小鼠睾丸和卵巢中特异性表达;(2)利用抗原设计、原核表达和抗体制备技术获得了针对SLX2蛋白的特异性多克隆抗体;(3)在蛋白水平上,利用免疫印迹技术检测不同组织和不同阶段的睾丸和卵巢发现,Slx2编码的蛋白特异性的表达于出生后的睾丸组织和出生前的卵巢组织中;(4)通过制备的多克隆抗体进行免疫组化试验发现该蛋白与磷酸化组蛋白H2AX一起共定位在第一次减数分裂期的XY小体上。SLX2的表达趋势与γH2AX的表达相似,而γH2AX是一个在减数分裂期特异性表达的蛋白,该蛋白与DNA损伤修复和性染色体的失活相关,该结果表明SLX2参与了XY小体的形成、DNA损伤修复和性染色体的失活;(5)利用酵母双杂交和免疫共沉淀试验发现,SLX2与减数分裂复合体重要组成蛋白SYCE2和乙酰转移酶KAT5/TIP60有相互作用,同时γH2AX蛋白和KAT5/TIP60蛋白相互作用一起参与了同源染色体重组和DNA断裂修复。上述结果表明SLX2蛋白与SYCE2蛋白参与了联会复合体的形成、同源重组和染色体断裂修复;上述结果还表明SLX2、SYCE2、KAT5/TIP60和γH2AX蛋白一起参与了减数分裂过程中的联会复合体的形成、同源染色体重组、DNA断裂修复和性染色体的失活等过程。　　 研究三,一个小鼠新基因Xlr5c的克隆、表达和鉴定,该基因所编码的蛋白参与初级精母细胞第一次减数分裂的过程。　　 研究结果显示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR检测不同组织和不同阶段的睾丸发现Xlr5cmRNA只在小鼠睾丸和卵巢中特异性表达;(2)利用蛋白抗原设计、原核表达和抗体制备技术获得了针对XLR5C蛋白的多克隆抗体;(3)在蛋白水平上,利用免疫印迹技术检测不同组织和不同阶段的睾丸发现,Xlr5c编码的蛋白特异性的表达于睾丸和卵巢组织中;它的表达明显发生在精子减数分裂的时间段中,该结果表明Xlr5c是一个时间相关性的基因,主要出现在精子发生的早期;(4)通过制备的多克隆抗体进行免疫组化试验发现,该蛋白定位在睾丸的生精细胞中,主要出现在发生减数分裂的精母细胞细胞核中。该结果显示该基因所编码的蛋白参与了精母细胞减数分裂的进程;此外,在雌性卵泡的细胞质中也检测到它的表达。上述结果表明,该蛋白可能还参与精母细胞减数分裂的进程,可能在卵母细胞减数分裂中也有一定的功能。　　 研究四,荧光原位杂交分析研究X染色体在生殖细胞中的定位,该定位可以作为牛(水牛)分离精子纯度鉴定和早期胚胎性别鉴定的一种客观鉴定手段。　　 研究结果显示:(1)利用显微切割技术和PCR技术制备了具有检测有效性的牛X染色体荧光原位杂交探针;该探针可以特异性的与牛中期染色体的X染色体杂交;(2)荧光原位杂交检测发现牛X染色体探针能检测牛和水牛正常和分离精子的比率及早期胚胎卵裂球的性别。上述试验结果表明牛X染色体荧光原位杂交探针可以作为一种十分有效的方法用于牛和水牛分离精子比率的鉴定和早期胚胎性别的鉴定。　　 研究五,分析和研究活性线粒体在水牛卵巢颗粒细胞、精子细胞、体外培养成熟前后的卵母细胞以及早期胚胎发育过程中的凋亡、分布和变化。　　 研究结果显示:(1)检测结果发现来源于中型(3～6mm)卵泡的卵巢颗粒细胞的凋亡率明显低于来源于大型卵泡(＞6mm)和小型卵泡(＜3mm)的颗粒细胞的凋亡率;(2)精子的活性线粒体主要定位在精子的尾部中段,这表明水牛精子尾部的运动所消耗的能量主要来源于其线粒体所产生的ATP;(3)在体外培养成熟前后的卵母细胞中检测发现,活性线粒体的分布变化趋势主要是从卵子的周边逐渐向卵子的中心和染色体部位聚集;(4)在体外受精的合子细胞中,活性线粒体主要聚集在两个原核的周边;(5)活性线粒体在体外培养的不同时期的植入前胚胎中发生明显的位移变化。总之,水牛卵巢颗粒细胞的凋亡率与卵泡的大小有关;活性线粒体在水牛卵母细胞的体外成熟、受精和早期胚胎发育过程中发生显著的位移变化,这表明线粒体可能在上述过程中扮演着重要的角色。